Toracico Spinal Cord Emisezione Chirurgia e valutazione locomotoria a campo aperto nel ratto

Summary

L’emisezione spinale toracica del ratto è un modello prezioso e riproducibile di lesioni unilaterali del midollo spinale per studiare i meccanismi neurali del recupero locomotorio e l’efficacia del trattamento. Questo articolo include una guida dettagliata passo-passo per eseguire la procedura di emisezione e per valutare le prestazioni locomotorie in un’arena a campo aperto.

Abstract

La lesione del midollo spinale (SCI) provoca disturbi nella funzione motoria, sensoriale e autonomica al di sotto del livello della lesione. I modelli animali sperimentali sono strumenti preziosi per comprendere i meccanismi neurali coinvolti nel recupero locomotorio dopo la SCI e per progettare terapie per le popolazioni cliniche. Ci sono diversi modelli sperimentali di SCI, tra cui lesioni di contusione, compressione e transezione che vengono utilizzati in un’ampia varietà di specie. Un’emisezione comporta la transezione unilaterale del midollo spinale e interrompe tutti i tratti ascendenti e discendenti su un solo lato. L’emisezione spinale produce una lesione altamente selettiva e riproducibile rispetto alle tecniche di contusione o compressione che è utile per studiare la plasticità neurale nei percorsi risparmiati e danneggiati associati al recupero funzionale. Presentiamo un protocollo dettagliato passo-passo per eseguire un’emisezione toracica a livello vertebrale T8 nel ratto che si traduce in una paralisi iniziale dell’arto posteriore sul lato della lesione con recupero spontaneo graduato della funzione locomotoria su più Settimane. Forniamo anche un protocollo di punteggio locomotore per valutare il recupero funzionale in campo aperto. La valutazione locomotore fornisce un profilo di recupero lineare e può essere eseguita sia precoce che ripetutamente dopo l’infortunio al fine di vagliare accuratamente gli animali in base ai punti temporali appropriati in cui condurre test comportamentali più specializzati. La tecnica dell’emisezione presentata può essere facilmente adattata ad altri modelli e specie di transezione, e la valutazione locomotore può essere utilizzata in una varietà di Modelli di SCI e altri modelli di lesioni per ottenere la funzione locomotoria.

Introduction

La lesione del midollo spinale (SCI) è associata a gravi disturbi nella funzione motoria, sensoriale e autonomica. I modelli animali sperimentali di SCI sono strumenti preziosi per comprendere gli eventi anatomici e fisiologici coinvolti nella patologia SCI, per studiare i meccanismi neurali nella riparazione e nel recupero e per valutare l’efficacia e la sicurezza di potenziali terapie Interventi. Il ratto è la specie più comunemente utilizzata nella ricerca SCI¹. I modelli di ratto sono a basso costo, sono facili da riprodurre e una grande batteria di test comportamentali sono disponibili per valutare i risultati funzionali². Nonostante alcune differenze nelle posizioni del tratto, il midollo spinale del ratto condivide nel complesso funzioni sensomotorie simili con i mammiferi più grandi, compresi i primati^3,4. I ratti condividono anche conseguenze fisiologiche e comportamentali analoghe alla SCI che si riferiscono agli esseri umani⁵. I primati non umani e i grandi modelli animali possono fornire un’approssimazione più ravvicinata della SCI⁶ umana e sono essenziali per dimostrare la sicurezza e l’efficacia del trattamento prima della sperimentazione umana, ma sono meno comunemente utilizzati a causa del benessere etico e animale considerazioni, spese e requisiti normativi⁷.

I modelli SCI di transezione del ratto vengono eseguiti dall’interruzione mirata del midollo spinale con una lesione selettiva utilizzando un coltello di dissezione o forbici iridectomia dopo una laminectomia. Rispetto a una transsezione completa, la transezione parziale nel ratto si traduce in una lesione meno grave, una più facile cura degli animali postoperatori, un recupero locomotore spontaneo e modelli più strettamente spettrali di SCI negli esseri umani, che è prevalentemente incompleto con la parsimonia parziale tessuto che collega il midollo spinale e le strutture sovraspinali⁸. Un’emisezione unilaterale interrompe tutti i tratti ascendenti e discendenti da un solo lato e produce deficit locomotori quantificabili e altamente riproducibili, migliorando l’esplorazione dei meccanismi biologici sottostanti. La conseguenza funzionale più prominente dell’emisezione è una paralisi iniziale degli arti sullo stesso lato e al di sotto del livello della lesione con recupero spontaneo graduato della funzione locomotoria per diverse settimane^{9,10, 11 Del} sistema di ^{, 12.}Il modello dell’emisezione è particolarmente utile per studiare la plasticità neurale dei tratti e dei circuiti danneggiati e residui associati al recupero funzionale^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. In particolare, l’emisezione eseguita a livello toracico, cioè sopra i circuiti spinali che controllano la locomozione degli arti posteriori, è particolarmente utile per studiare i cambiamenti nel controllo locomotore. Poiché esiste una relazione non lineare tra la gravità delle lesioni e il recupero locomotorio dopo SCI¹⁹, un test comportamentale appropriato per valutare i risultati funzionali è fondamentale nei modelli sperimentali.

Una batteria completa di test comportamentali sono disponibili per valutare aspetti specifici del recupero locomotore funzionale nel ratto^2,20. Molti test locomotori non forniscono misure affidabili nelle prime fasi successive alla SCI, in quanto i ratti sono troppo disabili per sostenere il loro peso corporeo. Una misura delle prestazioni postmotorie spontanee sensibili ai deficit precocemente dopo l’infortunio e non richiede un allenamento preoperatorio o attrezzature specializzate è utile per monitorare il recupero locomotore per i punti di tempo appropriati in cui integrare test comportamentali specializzati. Il punteggio di valutazione open-field Martinez¹⁰, originariamente sviluppato per valutare le prestazioni del locomotore dopo la SCI cervicale nel ratto, è un punteggio ordinale di 20 punti che valuta le prestazioni locomotorie globali durante la locomozione sotterranea spontanea in un campo aperto. Il punteggio viene condotto separatamente per ogni arto utilizzando una rubrica che valuta parametri specifici di una serie di misure locomotorie, tra cui il movimento degli arti articolari, il supporto del peso, la posizione della cifra, le capacità di stepping, la coordinazione degli arti anteriori e dell’arto posteriore e la coda posizione. Il punteggio di valutazione è derivato dalla scala di valutazione open-field Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) progettata per valutare le prestazioni locomotorie dopo la contusione toracica²¹. È adattato per valutare in modo accurato e affidabile sia la funzione locomotore anteriore che quella degli arti posteriori, consente una valutazione indipendente dei diversi parametri di punteggio che non sono disponibili con il punteggio gerarchico della BBB e fornisce un recupero lineare profilo¹⁰. Inoltre, rispetto alla BBB, il punteggio di valutazione è sensibile e affidabile nei modelli di infortunipiù più gravi^10,11,20,22. Il punteggio di valutazione è stato utilizzato per valutare la compromissione locomotoria nel ratto dopo la sierzia^10,12 e la sola SCI toracica⁹ e in combinazione con lesioni cerebrali traumatiche²³.

Vi presentiamo qui un protocollo dettagliato passo-passo per l’esecuzione di un’emisezione toracica SCI a livello vertebrale T8 nel ratto femmina Long-Evans, e per valutare il recupero locomotore degli arti posteriori nel campo aperto.

Protocol

Gli esperimenti descritti in questo articolo sono stati effettuati in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono stati approvati dal comitato etico dell’Università di Montréal. 1. Chirurgia dell’emisezione toracica Indossare attrezzature protettive adeguate (guanti, maschera e abito) per mantenere un ambiente asettico per la chirurgia. Pulire l’area chirurgica con salviette alcoliche e posizionare tende chirurgiche sterili sul campo chirurgico. Steril…

Representative Results

Le lesioni riproducibili con un alto grado di coerenza possono essere generate con la tecnica dell’emisezione. Per valutare e confrontare le dimensioni delle lesioni tra gruppi sperimentali, l’area massima della lesione come percentuale della sezione trasversale totale del midollo spinale può essere facilmente calcolata con la colorazione istologica delle sezioni del midollo spinale. La figura 1 mostra una lesione rappresentativa dell’emicordone sinistra e una sovrapposizione della proporzi…

Discussion

Un punto di forza della tecnica dell’emisezione è la selettività e riproducibilità della lesione che porta a una ridotta variabilità nei fenotipi istologici e comportamentali tra gli animali²⁵. Al fine di garantire una lesione unilaterale al livello spinale appropriato, è fondamentale un’identificazione accurata sia del segmento vertebrale appropriato che della linea mediana del midollo spinale. Poiché può esserci una tendenza per il midollo spinale a ruotare nella direzione del taglio dura…

Materials

Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc