Summary
Мы представляем протокол для изучения распределения митохондрий и эндоплазмической ретикулум в целых клетках после генетической модификации с использованием корреляционного света и объема электронной микроскопии, включая аскорбат омоксидазы 2 и преносида хрена окисления, серийное сечение клеток с геном-мишенью и без нее в том же разделе, а также серийное изображение с помощью электронной микроскопии.
Abstract
Сотовые органеллы, такие как митохондрии и эндоплазмический ретикулум (ER), создают сеть для выполнения различных функций. Эти высоко изогнутые структуры складываются в различные формы, чтобы сформировать динамическую сеть в зависимости от клеточных условий. Визуализация этой сети между митохондриями и ER была предпринята с помощью сверхразрешения флуоресценции и световой микроскопии; однако, ограниченное разрешение недостаточно для того чтобы наблюдать мембраны между митохондриями и ER в деталях. Электронная микроскопия передачи обеспечивает хороший мембранный контраст и разрешение нанометрового масштаба для наблюдения клеточных органелл; однако при оценке трехмерной (3D) структуры высокоизосведой органелл занимает исключительно много времени. Поэтому мы наблюдали морфологию митохондрий и ER с помощью корреляционной светоэлектронной микроскопии (CLEM) и методов микроскопии объемной электронной микроскопии с использованием улучшенной аскорбатной перекоксидазы 2 и окисления перекисания хрена. Для наблюдения за трехмерной структурой применялись методок окрашивания, ультратонкий серийный сечение (массивная томография) и объемная электронная микроскопия. В этом протоколе мы предлагаем сочетание CLEM и 3D электронной микроскопии для проведения детальных структурных исследований митохондрий и ER.
Introduction
Митохондрии и эндоплазмический ретикулум (ER) являются мембранными клеточными органеллами. Их связь необходима для их функции, и белки, связанные с их сетью, были описаны1. Расстояние между митохондриями и ER было сообщено как приблизительно 100 nm используя световую микроскопию2; однако, недавние супер-разрешение микроскопии3 и электронной микроскопии (EM)4 исследования показали, что он будет значительно меньше, примерно на 10-25 нм. Разрешение, достигнутое в микроскопии супер-разрешения ниже, чем EM, и требуется специальная маркировка. EM является подходящим методом для достижения достаточно высокого разрешения контраста для структурных исследований связей между митохондриями и ER. Однако недостатком является ограниченная информация z-оси, поскольку тонкие секции должны быть примерно на 60 нм или тоньше для обычной электронной микроскопии передачи (TEM). Для достаточного изображения EM z-оси можно использовать трехмерную электронную микроскопию (3DEM). Однако это предполагает подготовку сотен тонких серийных секций целых клеток, что очень сложно сделать, что освоили лишь немногие опытные технологи. Эти тонкие секции собраны на хрупких formvar пленки покрытием одноотверстие TEM сетки. Если пленка ломается на одном поясе, серийная визуализация и реконструкция громкости невозможны. Серийный блок-лицо сканирования электронной микроскопии (SBEM) является популярным методом для 3DEM, который использует разрушительные en блок секции внутри сканирующего электронного микроскопа (SEM) вакуумной камеры либо с алмазным ножом (Dik-SBEM) или целенаправленной ионный луч (FIB-SEM) 6. Однако, поскольку эти методы не доступны на всех объектах, мы предлагаем массив томографии7 с использованием последовательного секции и SEM. В массивной томографии серийные секции, вырезанные с помощью ультрамикротома, переносятся на стеклянный покрывало вместо сетки TEM и визуализируются с помощью световой микроскопии и SEM8. Для повышения сигнала для backscatter электрона (BSE) изображения, мы использовали ан блок EM окрашивания протокола с использованием осмия тетрокида (OsO4) фиксированные клетки с osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH)9, что позволяет нам получать изображения без после встраивания двойное окрашивание.
Кроме того, митохондриальный маркер SCO1 (цитохром c окислидаса сборки белка 1) - аскорбат переоксидазы 2 (APEX2)10 молекулярный тег был использован для визуализации митохондрий на уровне ЭМ. APEX2 составляет около 28 kDa и является производным от сои аскорбат перекиснидаза11. Он был разработан, чтобы показать подробное расположение конкретных белков на уровне EM таким же образом, что зеленый флуоресцентный белок помечены белка используется в световой микроскопии. APEX2 преобразует 3,3' -диаминобензидин (DAB) в нерастворимый осмиофильный полимер в месте тега в присутствии кофакторного перекиси водорода (H2O2). APEX2 может быть использован в качестве альтернативы традиционной маркировки антител в EM, с локализацией белка на всей глубине всей клетки. Другими словами, белок с маркировкой APEX2 может быть визуализирован специфическим осмицией11 без маркировки иммуногольдов и пермяки после ультракриосекции. Хрендиш пероксидаза (HRP) также чувствительный тег, который катализирует H2O 2-зависимых полимеризации DAB в локализованный осадок, обеспечивая EM контраст после лечения с OsO4. ER целевой пептид последовательности HRP-KDEL (лис-асп-глу-лей)12 был применен для визуализации ER в рамках всей клетки. Для оценки нашего протокола использования генетических тегов и окрашивания ан блока с уменьшенным осмием и TCH (метод ROTO), используя эффект осмии в то же время, мы сравнили мембранный контраст с и без использования каждой генетической метки в rOTO ан блок окрашивания. Хотя 3DEM с массивом томографии и DAB окрашивания с APEX и HRP, соответственно, были использованы для других целей, наш протокол уникален, потому что мы объединили массив томографии для 3DEM и DAB окрашивания для митохондрий и ER маркировки. В частности, мы показали пять клеток с и без APEX помечены генов в том же разделе, который помогал в исследовании влияния генетической модификации на клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная культура с узорчатой сеткой культуры блюдо и клеточной трансфекции с SCO1-APEX2 и HRP-KDEL плазмидный вектор
- Семена 1 х 105 HEK293T клетки, поместив их в 35-мм стеклянной сетки дном культуры блюда в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2 при 37 КС в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM) дополнен 10% плода крупной сыворотки, 100 U/mL пенициллин и 100 U/mL стрептомицин.
- На следующий день после посева клеток, когда они выросли до 50%-60% confluency, ввести SCO1-APEX210 и HRP-KDEL12 плазмид в клетки с помощью трансфекционного реагента в соответствии с инструкциями производителя (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 мкг HrP-KDEL плазмид ДНК 0,5 мкг на 3 Л трансфекционного реагента).
2. Легкая микроскопия клеток, растущих на узорчатых культурных блюдах и DAB окрашивания для APEX2 и HRP
- При 16-24 ч после трансфекции удалите все культурно-носители и немедленно добавьте 250 кл теплого (30-37 градусов по Цельсию) раствор фиксации(Таблица 1) путем нежного пипетки. Немедленно снимите раствор фиксации и замените его 1,5 мл свежего раствора фиксации. Инкубировать на льду в течение 60 мин, а затем мыть три раза в течение 10 минут каждый в 1 мл ледяной 0,1 М буфер акодилат натрия(таблица 1).
ВНИМАНИЕ: Пары альдегида чрезвычайно токсичны. Выполните все работы под вентилируемым дымом капот. - Добавьте 1 мл холодного (0-4 градусов) 20 мм глицина раствор и инкубировать в течение 10 минут на льду, а затем три стирок по 5 мин каждый в 1 мл холодного 0,1 М буфера какокилата натрия.
- Приготовьте свежий раствор 1x DAB (3,33 мл из 0,3 м какокилатного раствора, 10 л 30% Н2O2 5,67 мл холодной воды, 1 мл 10x DAB раствор).
- Добавьте 500 зл и свежеприготовленный раствор 1x DAB (шаг 2.3) и инкубируют на льду в течение примерно 5-45 мин до тех пор, пока под перевернутым световым микроскопом не будет видно светло-коричневого пятна(рисунок 1А).
- Аккуратно удалите раствор DAB и промыть три раза с 1 мл холодного 0,1 М буфера какодилат натрия в течение 10 минут каждый.
- Используйте фазовый контрастный перевернутый микроскоп (или световой микроскоп яркого поля) для визуализации окрашивания DAB при увеличении в 100 раз или выше. Используйте маркерпер, чтобы отметить дно стекла, где находится область интереса (ROI)(рисунок 1B,C).
3. Подготовка образца для блока EM
- Выполните клеточную культуру и окрашивание DAB, как описано в шагах 2.1-2.6.
- Пост-фиксировать образцы с 1 мл 2% снижение OsO4 для 1 ч при 4 c.
ВНИМАНИЕ: OsO4 паров являются высокотоксичными. Выполните все работы под вентилируемым дымом капот. - Подготовьте новое решение TCH(таблица 1) во время шага 3.2 и пройдите через фильтр 0.22-мкм.
ВНИМАНИЕ: Пары TCH являются высокотоксичными. Выполните все работы под вентилируемым дымом капот. - Удалить фиксатор и промыть три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый при комнатной температуре (RT).
- Поместите клетки в 1 мл ранее подготовленного и отфильтрованного раствора TCH в течение 20 минут на RT.
- Промыть клетки три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT.
- Выставить клетки во второй раз до 1 мл 2% тетроксида осмия в дистиллированной воде в течение 30 минут на РТ.
- Удалить фиксатор и промыть три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT. Добавить 1 мл 1% уранил ацетат (aqueous), и оставить на ночь при 4 градусах По Цельсию в темноте.
- Вымойте клетки три раза в 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT.
- Предварительно разогреваемом уидяшном растворе Уолтона(Таблица 1) в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
- Пятно клеток с Уолтон свинца аспартат решение, добавив 1 мл предварительно подогретого свинца аспартат аспартат аспартат азатем, а затем поместить в духовку на 30 мин при 60 градусов по Цельсию.
- Промыть клетки три раза с 1 мл дистиллированной воды в течение 5 минут каждый на RT.
- Инкубировать в градуированных сериях 2-мл этанола aliquots (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) в течение 20 минут каждый на RT.
- Декант этанола и инкубировать в течение 30 мин в 1 мл 3:1 этанол: низкая вязкость встраивания смеси среды на RT.
- Удалить среду и добавить 1 мл 1:1 этанола: низкая вязкость встраивания смеси среды. Инкубировать в течение 30 минут на RT.
- Удалите среду и добавьте 1 мл 1:3 этанола: низковязкая встраивающая смесь среды. Инкубировать в течение 30 минут на RT.
- Удалите среду и добавьте 1 мл 100% низкой вязкости встраивания среды и инкубировать на ночь.
- Встраивайте образец в 100% низковязкую встраивающую смесь и инкубировать 24 ч при 60 градусах Цельсия.
- Подготовка 90-нм толщиной разделов с помощью ультрамикротома.
- Наблюдайте за сеткой под TEM на 200 кВ.
4. Серийное секционирование и монтаж на обшивки с покрытием с покрытием для SEM
-
Субстратная подготовка
- Чистый индиум-оловен-оксид (ITO) покрытием крышки (22 мм х 22 мм) нежным возбуждением в изопропанола для 30-60 с.
- Удалите крышки, слейте лишний изопропанол и оставьте в безпылящей среде до высыхания.
- Лечить ITO покрытием стеклянные крышки свечение разряда с помощью плазмы пальто в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазма активации наделяет гидрофильных свойств о поверхности субстрата. Это создает очень тонкую пленку воды на субстрате, чтобы предотвратить образование морщин в разделах, когда секция прикреплена к субстрату. - Вставьте стекло с покрытием ITO в держатель подсубстрата и поместите в лодку с ножом.
-
Обрезка блока образца и последовательное секции
- Вставьте блок образца в держатель образца ультрамикротома и установите в блок обрезки.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать все излишки мишени вокруг целевого положения (определено в шаге 2.6, Рисунок 1D-G). Форма блочной грань должна быть трапециевидной или прямоугольной. Передний край и задний край должны быть абсолютно параллельными(Рисунок 1H,I).
- Вставьте держатель образца на руку ультрамикротома и поместите алмазный нож в держатель ножа. Вставьте стекло ITO крышки в ленту перевозчика и зажим перевозчика с ручкой(Рисунок 1J). Установите ленту перевозчика в нож лодки и заполнить нож лодки с фильтрованной дистиллированной воды(рисунок 1K).
- Отрегулируйте положение носителя с слайдом ножа, осторожно нажав на ручку держателя, чтобы установить край стекла ITO близко к ноже(Рисунок 1L).
- После разреза секции остановите процесс секции и медленно откройте зажимный винт трубки и слейте водную лодку (скорость потока одной капли воды в секунду).
- После завершения процесса сбора ленты снимите субстрат с ручкой зажима устройства и высушите ленту(рисунок 1М).
5. Изображение в SEM и выравнивание стека изображений SEM
- Установите крышку с покрытием ITO на алюминиевые заглушки с липкой углеродной лентой. Печать стеклянной поверхности и поверхности в заглушку с липкой углеродной лентой, а затем пальто с 10-нм толщиной углеродного слоя(рисунок 1N).
- Обратите внимание на покрытие ITO покрытием в полевых выбросов SEM при низком ускоренном напряжении 5 кВ и подходящее рабочее расстояние для эффективного сбора BSEs.
- Импортируйте серийные изображения в программное обеспечение Image J (Фиджи)13 с помощью опции виртуального стека. Откройте новый TrakEM14и импортируйте стек изображения в TrakEM. Нажмите кнопку «Правая мышь» и выберите меню выравнивания.
- Затем выберите диапазон изображений (от первого изображения до последнего изображения). Завершите автоматическое выравнивание, сохраните выровненный набор данных и выберите экспорт для компиляции плоского изображения из выбранного диапазона изображений (от первого изображения до последнего изображения). Наконец, сохраните плоские данные изображения в формате AVI в главном меню Image J.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный фильм 1 и дополнительный фильм 2 показать SEM стек изображения и обрезанные изображения стек, соответственно.
6. Сегментация митохондрий и ER от серийных изображений
- Запустите 3dmod в iMOD15 программного обеспечения и открытых файлов изображений.
- В окне ЗаП нарисуйте контур митохондрий и ER с помощью кнопки «средняя мышь».
- Чтобы визуализировать сегментированный объем, откройте окно Model View (Дополнительныйфильм 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 описывает расписание и рабочий процесс для этого протокола. Протокол требует 7 дней; однако, в зависимости от времени, затраченного на sem изображения, это может увеличиться. Для трансфекции клеток, выпуклость клеток должна контролироваться, чтобы не покрывать нижнюю часть всей пластины сетки(рисунок 1A). Высокая плотность клеток может предотвратить выявление ячейки интереса во время светового микроскопа и EM наблюдения. Мы использовали генетически помеченные плазмиды, которые выражали APEX2 и HRP, чтобы выбрать эффективно трансинфицированные клетки среди многочисленных культивированных клеток в культурном блюде. Мы культивировали клетки HEK293T и подтвердили экспрессию связанного с SCO1 APEX2 (митохондриального межмембранного пространства «IMS») и HRP-конъюгированного KDEL (ER) в котранс-инфицированных клетках. Под световой микроскопией, APEX2-транс-инфицированных клеток были окрашены в коричневый цвет, в то время как клетки без трансфекции остались неокрашенными(рисунок 1A и рисунок 2). Это позволило идентифицировать транс-инфицированные клетки-мишени, которые затем использовались для корреляционной светоэлектронной микроскопии (CLEM), используя dAB окрашивание в популяции культурных клеток(рисунок 3D-F и рисунок 4B). Было полезно отметить стеклянное дно(рисунок 1B,C),чтобы было легко определить местоположение целевой ячейки во время плоского шага встраивания (Рисунок 1E,F). Когда клетки HEK293T были обработаны с увеличенным протоколом окрашивания «двойного osmium» (rOTO), целые клетки были запятнаны темным цветом(рисунок 1D). После удаления сетки coverslip из культуры блюдо, мы определили целевое место на поверхности блока под стерео микроскопом (Рисунок 1G). Мы обрезали клетки в рентабельности инвестиций в трапециевидной форме, и ведущие и задние края были сделаны параллельно(Рисунок 1H,I). Для реализации реконструкции митохондрий и ER-сети мы использовали большой алмазный нож с большой водяной лодкой для последовательного раздела SCO1-APEX2 и HRP-KDEL-выражения HEK293T(рисунок 1J-L). Серийные 90-нм толщиной ленты разделы были успешно прикреплены к ITO покрытием стекла coverslip(рисунок 1M), и поверхность была покрыта 10-нм толщиной углерода для наблюдения через SEM (Рисунок 1N).
Белки SCO1-APEX2 и HRP-KDEL генерируют высокоплотные электронные сигналы, полученные из преобразования DAB, которые обнаруживаются в TEM(рисунок3) и SEM (рисунок4). Темное пятно, генерируемое SCO1-APEX2, наблюдалось исключительно в IMS, а не в матрическом пространстве митохондрий(рисунок 3D). Котранс-инфицированные клетки (левая клетка на рисунке 3D,E)с плазмидой SCO1-APEX2 и HRP-KDEL выражали очень плотный электронный сигнал в митохондриальных IMS и ER; однако, мы не наблюдали ER окрашивания в клетках, которые были трансинфицированы только с SCO1-APEX2 (правая клетка на рисунке 3D,F). Для серийных изображений с помощью SEM, во-первых, мы создали обзор всего массива изображения с помощью детектора BSE на большой площади(рисунок 4A). Во-вторых, рентабельность инвестиций была помещена в первый раздел и распространена на все остальные разделы(рисунок 4B). Наконец, мы визуализировали рентабельность инвестиций, содержащую пять целевых ячеек с пикселями изображения 5 нм(рисунок 4C). Увеличенные изображения показали подробные субклеточные структуры(Рисунок 4D), такие как аппарат Golgi, митохондрии, ядра, и ER. Серийные изображения ясно показали, что ER-митохондрии контакты происходили на различных z-самолетов(Дополнительный фильм 2 и дополнительный фильм 3).
Рисунок 1 : S достаточно подготовки рабочего процесса для SEM и TEM. (A) Культура блюдо, содержащее сетчатые крышки был посеян с клетками и окрашенных DAB. (B,C) После окрашивания DAB, маркер перо было использовано для обозначения нижней части стекла, где целевые клетки были расположены. (D) После OsO4 окрашивания, клетки становятся темным цветом. (E,F) Полимеразы цепной реакции (ПЦР) трубки (или любой тип встраивания капсулы) были использованы, чтобы легко сделать блок EM, который содержал отмеченные позиции. (E) Вид сверху. (F) Вид снизу. (G) Низкое увеличение стерео микроскопии изображения поверхности блока EM. (H) РЕНТАБЕЛЬНОСТь инвестиций находится в середине плоской поверхности. (I) Высокое увеличение стерео микроскопии изображения прямоугольной рентабельности инвестиций. (J) ITO покрытием стеклянные крышки (белая звездочка) вставляются в ленту перевозчика (синяя стрелка), и перевозчик зажат, повернув ручку по часовой стрелке. (K,L) Ручка держателя тщательно нажата, и несущая отрегулирована для того чтобы расположить край крышки покрынного ITO близко к ноже путем сползать. (M) Ленты прикрепляются к стеклянным крышкам с покрытием ITO. (N) ITO покрытием стеклянные крышки прикрепляются к SEM заглушки, и остаточный стекло запечатан липкой углеродной лентой и покрыты 10-нм слоя углеродной нити. Белые звездочки указывают на стеклянную крышку с покрытием ITO, а черные звездочки — углеродную ленту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Перевернутое фазово-контрастное микроскопию изображения культивированных клеток HEK293T, окрашенных DAB. (A) Окрашивание клеток только DAB (без OsO4 окрашивания). Белые стрелки указывают на неокрашенные клетки, а черные стрелки — на окрашенные DAB клетки. (B) Высшее увеличение изображения рентабельности инвестиций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : TEM-изображение клеток HEK293T, демонстрирующих целевые митохондриальные IMS (SCO1-APEX2) и ER (HRP-KDEL). (A-C) Нетрансинфицированные клетки HEK293T, показывающие двойную мембрану митохондрий (М) и эндоплазмический ретикулум (ER). (D-F) APEX2 и HRP катализируют полимеризацию DAB в местный осадок, который впоследствии окрашивается электронным плотным OsO4. Темный контраст проявляется в митохондриальных IMS (черная стрелка) и ER (черная стрелка); однако, клетки, которые не были трансфицироваться HRP-KDEL экспонат неокрашенных ER (белая стрелка). Шкала баров: 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Серийная визуализация SEM клеток HEK293T, демонстрирующих целевые митохондриальные IMS (SCO1-APEX2) и ER (HRP-KDEL). (A) Обзор серийных лент раздела наблюдается с помощью детектора BSE. (B) Корреляция изображения с низким увеличением (вставка) с изображением с высоким увеличением BSE (белая пунктирная коробка указывает на рентабельность окрашенных DAB клеток). (C) Высокое увеличение целевых ячеек ROI с пикселями изображения 5 нм. (D,E) Темный контраст проявляется в митохондриальных IMS и ER, но не в аппарате Golgi. (F-I) Контакты ER-митохондрий (белая стрелка) происходят на разных z-самолетах. N, ядро; M, митохондрии; ER, эндоплазмический ретикулум; G, аппарат Голги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Рецепты решений.
Дополнительный фильм 1: стек изображения SEM. Фиджи13 с TrakEM14 программное обеспечение было использовано для выравнивания 91 изображений. Исходный набор приведенных в соответствие данных составляет 11 ГБ. Для сокращения стека был использован набор изображений с пересчетом и обрезанный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Дополнительный фильм 2: Обрезанный стек изображений. Для детальной визуализации митохондрий, ER и их контактных сайтов изображения были обрезаны из исходного набора данных (5 нм/пиксель). Масштаб баров: 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Дополнительный фильм 3: 3D Реконструкция митохондрий и ER. Для 3D визуализации контур митохондрий и ER был сегментирован и визуализирован с помощью программного обеспечения IMOD15. Митохондрии были визуализированы как длинные трубчатые структуры (красные), а сети ER (зеленые) показали свою сложную морфологию. желтый представляет собой большую площадь участка контакта между митохондриями и ER в различных z-самолетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение клеточной локализации конкретных белков в разрешении нанометра с помощью EM имеет решающее значение для понимания клеточных функций белков. Как правило, Существует два метода для изучения локализации целевого белка через EM. Одним из них является метод иммуногольд, который был использован в EM с 1960 года, а другой метод, использующий недавно разработанные генетически закодированные метки16. Традиционные методы иммуногольд использовали антитела-конъюгированные частицы золота или квантовые точки, чтобы показать расположение помеченного белка. Однако, из-за требования к высококачественным антителам и эффективности проникновения антител, пораженных мишенями и фиксатором, эта техника значительно ограничена17. В частности, потому, что иммуногольд маркировки преимущественно ограничивается поверхностью ультратонкий раздел без en блок металлического окрашивания и сильной фиксации осмия, этот метод непосредственно не применяется к современным 3DEM18. Чтобы использовать последние методы 3DEM, включая SBEM и массивную томографию, с маркировкой белка, мы использовали генетически закодированные метки EM в этом протоколе. Генетически закодированные метки не требуют пермяковизации, технически требующей ультракриосекции и иммуносесценации отдельных секций, поскольку они локализованы на интересуемом месте до фиксации.
Процедуры подготовки образцов в 3DEM обычно включают в себя сочетание общей химической фиксации и тяжелых методов окрашивания металла, потому что клетки состоят в основном из C, H, O и N, требующих окрашивания тяжелыми металлами для приобретения контраста под EM9 . Поэтому мы использовали уменьшенную фиксацию осмия и металлическое окрашивание для повышения контрастности и проводимости для серийной визуализации. Процедура окрашивания образцов перед секцией, известная как окрашивание блока, была сообщена в качестве важного шага для 3DEM методов, таких как SBEM и FIB-SEM19. Мы подтвердили, что en блок окрашенных клеток в нашем протоколе продемонстрировали четкий SCO1-APEX2 и HRP-KDEL EM контраст исключительно в митохондриальной IMS и ER, соответственно, в TEM (Рисунок 3). Кроме того, SEM изображения из 90-нм серийных разделов показали четкий контраст в обоих органеллах(рисунок 4). Примечательно, что усиленный контраст с помощью окрашивания блока отчетливо отличался от сигнала DAB, а контрастность и проводимость приводили к качественному серийному изображению(рисунок 4). Кроме того, этот высокий контраст способствует упрощению последующих задач, таких как выравнивание и сегментация с трехмерным (3D) программным обеспечением изображения.
В последние годы методы объемной электронной микроскопии (дик-СБЭМ, FIB-SEM и массивная томография) ответили на биологические вопросы, которые требовали наблюдения большого поля зрения и 3D-обзора. Dik-SBEM и FIB-SEM не связаны с физическим обращением с секциями, поэтому время, отнимающее выравнивание изображений, может быть сокращено. Тем не менее, образец должен быть уничтожен для получения серийных изображений, и поле зрения меньше, чем у массива томографии. Серийная томография SEM с использованием массивной томографии все чаще используется в качестве альтернативы серийному сечению TEM, и основным преимуществом этой техники является ее неразрушающая манера и большое поле зрения. В отличие от других методов 3DEM, таких как dik-SBEM и FIB-SEM, разделы могут храниться на обложке, крышке с покрытием ITO, кремниевой пластине или ленте и могут быть неоднократно изображены7.
APEX2 прост в использовании и может дать широкий спектр окрашивания плотности без специального оборудования, в отличие от мини-генератор кислорода Синглет20 или флуоресцентный белок21 методы, генерации Осадков DAB через фотооксидации. Его переменное применение было протестировано в нескольких клеточных органеллах, включая ядро, плазменную мембрану, митохондриальную матрицу, митохондриальную крист, ER, тубулин и актин в COS 7 и HEK293T ячейке22. Однако существуют некоторые ограничения и несколько контрольно-пропускных пунктов для использования генетически закодированных пометок в электронных микрографах. Уровни экспрессии экзогенных генов должны контролироваться для достижения разумного окрашивания на уровне EM, потому что если экспрессия генетического тега слишком высока, это может вызвать ложноположительные сигналы и возмутить ультраструктуру клеток через разрыв мембраны и субклеточной агрегации органелл23. Другой возможной проблемой является DAB overstaining, который, как сообщается, вызывает размытость и разрушение мембраны22. Для обеспечения надлежащей экспрессии генов, DAB-окрашенные клетки были сопоставлены с неокрашенными клетками, используя как светлую микроскопию, так и EM(рисунок 2 и рисунок 3). Кроме того, уровень фиксации должен быть хорошо отрегулирован, чтобы эндогенные оксидазы были полностью неактивны. Чтобы предотвратить любые артефакты от эндогенных окислителей во время обработки, мы установили монослой клеток вместо использования отдельных и гранулированных клеток24. Это также помогло определить клетки, представляющие интерес, когда мы проверили сигнал DAB под световой микроскопией. Таким образом, наши результаты показывают, что окрашивание и фиксация клеточных монослойных полезны для CLEM с помощью DAB окрашивания(рисунок 2). Серийные изображения с массивом томографии и 3D-моделью показали, что контактные сайты ER-митохондрий встречаются на разных z-самолетах(Дополнительный фильм 2 и Дополнительный фильм3). Изображение производит полную 3D визуализацию митохондриальных и ER сетей в целых клетках(Дополнительный фильм 1). Он предполагает, что 3D-анализ объема имеет важное значение для количественного сравнения контактов с ЭР-митохондриями. При изучении сложных сетей внутриклеточных органелл это исключительно полезная техника.
В заключение, этот протокол был эффективным сочетанием методов CLEM и 3DEM, которые позволили исследования целых клеток на уровне EM. Примечательно, что два разных тега одновременно и сигналы DAB в двух разных органеллах были видны во всей клетке. Кроме того, помеченные клетки и немаркированные клетки в том же разделе можно сравнить, из-за крупномасштабного EM. В этом протоколе, en bloc окрашивания и DAB сигналы от генетически закодированных тегов были полезны для исследования взаимодействия между membranous органеллы в целых клетках. Это может быть подходящим приложением для крупномасштабных EM для изучения других сотовых взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано основной исследовательской программой KBRI через Корейский институт исследований мозга, финансируемый Министерством науки и ИКТ (19-BR-01-08), и ГрантОм Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым корейским правительством (MSIT)(Нет. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 и плазмиды HRP-KDEL любезно были предоставлены Хён У Ри (Суульский национальный университет). Данные TEM были получены на основных объектах исследования мозга в КБРИ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
