I denne artikel præsenterede vi et sæt praktiske og gennemførlige metoder til karakterisering af sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser, som omfatter in vitro-kinaseassay, RAF-Co-aktiverings analyse og supplerende split der-analyse.
Den hastigt accelererede fibrosarkom (RAF) familie kinaser spiller en central rolle i cellebiologi og deres dysfunktion fører til kræft og udviklingsmæssige lidelser. En karakterisering af sygdomsrelaterede RAF-mutanter vil hjælpe os med at udvælge passende terapeutiske strategier til behandling af disse sygdomme. Nylige undersøgelser har vist, at RAF Family kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter, som er stramt reguleret ved dimerisering. Her opbyggede vi en række praktiske og gennemførlige metoder til at bestemme de katalytiske og allosteriske aktiviteter og den relative dimer affinitet/stabilitet i RAF-familiens kinaser og deres mutanter. For det første ændrede vi den klassiske in vitro-kinaseanalyse ved at reducere koncentrationen af vaskemiddel i buffere ved hjælp af en blid hurtig vaske procedure og ved at anvende en glutathion S-transferase (GST) fusion for at forhindre RAF-dimere i at dissociere under Rensning. Dette gør det muligt for os at måle den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter på passende vis. For det andet udviklede vi en ny RAF-Co-aktiverings analyse for at evaluere den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter ved hjælp af N-terminal trunkerede RAF-proteiner, hvilket eliminerer kravet om aktive RAS i de nuværende protokoller og dermed opnår en højere Følsomhed. Endelig, vi genereret en unik supplerende split der assay til kvantitativt at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af forskellige RAF mutanter, som er mere pålidelig og følsom i forhold til den traditionelle Co-immunoprecipitation assay. Sammenfattende har disse metoder følgende fordele: (1) brugervenlig; 2) kan udføre effektivt uden avanceret udstyr 3) omkostningseffektiv (4) meget følsom og reproducerbar.
RAF-familiens kinaser er en vigtig bestanddel af Ras/RAF/Mek/Erk signalering Cascade, som sender et signal fra Ras for at aktivere mitogen-aktiveret proteinkinase (Mek)1,2,3,4. Denne familie af kinaser spiller en afgørende rolle i cellevækst, overlevelse og differentiering, og deres ændringer fremkalde mange sygdomme, især kræft5,6,7,8. For nylig har genomiske sequencings identificeret mange sygdomsrelaterede RAF mutanter, der udviser forskellige egenskaber i signalet transmission af Ras/RAF/Mek/Erk Cascade9,10,11. En omhyggelig karakterisering af RAF-mutanter vil hjælpe os med at forstå de molekylære mekanismer for, hvordan RAF-mutanter ændrer signal outputtet fra RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, til sidst vælger passende tilgange til behandling af forskellige RAF-mutant-drevne sygdomme.
RAF-familiens kinaser omfatter tre medlemmer, Craf, BRAF og Araf, som har lignende molekylære strukturer, men forskellige evner til at aktivere downstream-signalering1,2,3,4. Blandt disse paralogs har BRAF den højeste aktivitet i kraft af sin konstitutivt fosforyleret NTA (N–tTerminal acidic) Motif12,13,14, mens Araf har den laveste aktivitet som følge af dens ikke-kanoniske APE motiv15. Dette kan forklare de forskellige Mutations frekvenser af RAF paralogs i sygdomme: BRAF > CRAF > ARAF. Desuden kan mutationer på forskellige steder inden for samme RAF paralog udløse downstream-signalering i særskilte manerer, hvilket tilføjer endnu et lag af kompleksitet til reguleringen af RAF-familie kinaser. Nylige undersøgelser har vist, at alle RAF-kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter13,14,16,17,18. Konstitutivt aktive RAF-mutanter tænder downstream-signaleringen direkte ved fosforylerende MEK, hvorimod kinase-døde RAF-mutanter kan transaktivere deres vildtype-modparter gennem side-til-side-dimerisering og aktivere MEK-ERK signalering16 ,19,20. Den dimer affinitet/stabilitet er en nøgleparameter, der ikke kun bestemmer den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter, men også påvirker den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter15,21, 22. de kinase-døde RAF-mutanter med høj dimer affinitet/stabilitet kan transaktivere de endogene Wild-type RAFs direkte15, mens dem med mellemliggende dimer affinitet/stabilitet kræver en koordination af aktive RAS eller en forhøjet niveau af Wild-type RAF molekyler til funktion13,15,20,21,23. Tilsvarende, konstitutivt aktive RAF mutanter fosforylat Mek i en dimer-afhængige måde, og dem med lav dimer affinitet/stabilitet mister deres katalytisk aktivitet in vitro ved immun opstød, der bryder de svage RAF dimerer15, 21,22. Dimerens affinitet/stabilitet bestemmer også RAF-mutanternes følsomhed over for deres hæmmere og er positivt korrelerer til modstanden i RAF-hæmmere24. For at karakterisere sygdomsrelaterede RAF-mutanter er det derfor nødvendigt at måle deres katalytiske og allosteriske aktiviteter og dimer affinitet/stabilitet.
I de seneste år har vores laboratorium og andre udviklet forskellige metoder til at karakterisere RAF familie kinaser og deres mutanter. Ifølge vores laboratorium og andres erfaring, mener vi, at følgende tre assays har fordele ved at definere sygdomsrelaterede RAF mutanter: (1) in vitro kinase assay, der kan udføres med lethed til at detektere den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter15; (2) RAF-Co-aktiverings analysen, der er en pålidelig og bekvem metode til at måle den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter13,15,21,22,23, 25; (3) den gratis split der assay, der har meget større følsomhed i at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af RAF mutanter i modsætning til den traditionelle Co-immunoprecipitation assay, og er i stand til at udføre uden avanceret udstyr i i modsætning til de kvantitative analytiske metoder såsom spr (soverflaoeaktive Plasmon Resonance) analyse15,22. Ved at kombinere disse tre assays kan vi nemt forstå, hvordan en sygdomsrelateret RAF-mutant ændrer downstream-signaleringen og dermed udnytter en passende terapeutisk strategi til behandling af sygdommen forårsaget af denne RAF-mutation.
I denne artikel præsenterede vi tre metoder til karakterisering af sygdomsrelaterede RAF-mutanter, som omfatter in vitro-kinaseassay, RAF-Co-aktiverings analyse og gratis split der-analyse. Da RAF-kinaser har både katalytisk aktivitet og allosterisk aktivitet, kan forskellige RAF-mutanter aktivere downstream-signaleringen gennem to særskilte mekanismer13,14,16,17, <sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende den behårede celle Leukemia Fellowship for støtte af Yuan Jimin. Dette arbejde blev støttet af Asia fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge-finansierings pris (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF-overgangs tilskuddet (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) og SHF Academic Medicine Forskningstilskud (AM/TP011/2018).
anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |