Caratterizzare i mutanti correlati alla malattia di RAF Family Kinases utilizzando una serie di metodi pratici e fattibili
Summary
In questo articolo, abbiamo presentato una serie di metodi pratici e fattibili per caratterizzare i mutanti correlati alla malattia delle chinasi della famiglia RAF, che includono il saggio in vitro chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso complementare.
Abstract
Le chinasi della famiglia fibrosarcoma (RAF) rapidamente accelerato svolgono un ruolo centrale nella biologia cellulare e la loro disfunzione porta a tumori e disturbi dello sviluppo. Una caratterizzazione dei mutanti RAF correlati alla malattia ci aiuterà a selezionare strategie terapeutiche appropriate per il trattamento di queste malattie. Recenti studi hanno dimostrato che le retisi familiari della RAF hanno attività sia catalitiche che allosteric, che sono strettamente regolate dalla dimerizzazione. Qui, abbiamo costruito una serie di metodi pratici e fattibili per determinare le attività catalitiche e allosteric e la relativa affinità/stabilità di dimero delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti. In primo luogo, abbiamo modificato il classico saggio in vitro della chinasi riducendo la concentrazione di detergenti nei tamponi, utilizzando una delicata procedura di lavaggio rapido e impiegando una fusione di glutathione S-transferase (GST) per evitare che i dimeri della RAF si dissocino durante Purificazione. Questo ci permette di misurare l’attività catalitica dei mutanti RAF, in modo virile mente attivo. In secondo luogo, abbiamo sviluppato un nuovo saggio di co-attivazione della RAF per valutare l’attività allostricale dei mutanti NAsie-morti della RAF utilizzando proteine RAF troncate N-terminal, eliminando il requisito di Ras attivo nei protocolli attuali e ottenendo così un livello superiore sensibilità. Infine, abbiamo generato un unico test di lucidferasi diviso complementare per misurare quantitativamente l’affinità/stabilità relativa dei dimeri di vari mutanti RAF, che è più affidabile e sensibile rispetto al tradizionale test di co-immunoprecipitazioni. In sintesi, questi metodi presentano i seguenti vantaggi: (1) user-friendly; (2) in grado di effettuare efficacemente senza attrezzature avanzate; (3) conveniente; (4) altamente sensibili e riproducibili.
Introduction
Le chinasi della famiglia RAF sono un componente chiave della cascata di segnalazione RAS/RAF/MEK/ERK, che trasmette un segnale da RAS per attivare la proteina mitogen -linse (MEK)1,2,3. Questa famiglia di chinasi svolge un ruolo cruciale nella crescita cellulare, sopravvivenza e differenziazione, e le loro alterazioni inducono molte malattie, in particolare il cancro5,6,7,8. Recentemente, i sequenziature genomiche hanno identificato molti mutanti DELLA RAF correlati alla malattia che presentano diverse proprietà nella trasmissione del segnale della cascata RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Un’attenta caratterizzazione dei mutanti RAF ci aiuterà a capire i meccanismi molecolari di come i mutanti RAF alterano la produzione di segnale della cascata RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente selezionare approcci appropriati per il trattamento di varie malattie basate sui mutanti RAF.
Le chinasi della famiglia RAF comprendono tre membri, CRAF, BRAF e ARAF, che hanno strutture molecolari simili ma abilità diverse per attivare la segnalazione a valle1,2,3,4. Tra questi paraloghi, BRAF ha la più alta attività in virtù del suo coscione costitutivo NtA (N–terminal acidic) motivo12,13,14, mentre ARAF ha il più basso attività derivanti dal suo motivo APE non canonico15. Questo può spiegare le diverse frequenze di mutazione dei paralati RAF nelle malattie: BRAF>CRAF>ARAF. Inoltre, all’interno dello stesso paralogo RAF, le mutazioni in diversi siti possono innescare la segnalazione a valle in modi distinti, il che aggiunge un ulteriore livello di complessità alla regolazione delle chinasi della famiglia RAF. Recenti studi hanno dimostrato che tutte le chinasi RAF hanno attività catalitiche e allosteric13,14,16,17,18. I mutanti RAF constitutivemente attivi attivano la segnalazione a valle direttamente facendo fosfolare MEK, mentre i mutanti RAF che sono morti di parentesi possono trasattivare le loro controparti di tipo selvaggio attraverso la dimerizzazione laterale e attivare la segnalazione MEK-ERK16 ,19,20. L’affinità/stabilità dei dimeri è un parametro chiave che non solo determina l’attività allostricarica dei mutanti RAF cilasi-morti, ma influisce anche sull’attività catalitica dei mutanti RAF complessivamente attivi15,21, 22.I mutanti nasie-morti della RAF ad alta affinità/stabilità dei dimeri possono trasattivare direttamente i RAGF endogeni di tipo selvaggio15, mentre quelli con affinità/stabilità dilettante intermedia richiedono un coordinamento di elevato livello di molecole RAF di tipo selvatico per funzionare13,15,20,21,23. Allo stesso modo, i mutanti della RAF proattivi con stitusivi fosfo MEK in modo dipendente dai dimer, e quelli con bassa affinità/stabilità dei dimeri perdono la loro attività catalitica in vitro dopo l’immunoprecipitazioni che rompe i deboli dimeri della RAF15, 21,22. L’affinità/stabilità dei dimeri determina anche la sensibilità dei mutanti RAF ai loro inibitori, e correla positivamente alla resistenza degli inibitori della RAF24. Pertanto, per caratterizzare i mutanti DELLA RAF correlati alla malattia, è necessario misurare le loro attività catalitiche e allosteric e l’affinità/stabilità delle dimeri.
Negli ultimi anni, il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato vari metodi per caratterizzare le chinasi della famiglia RAF e i loro mutanti. Secondo il nostro laboratorio e l’esperienza di altri, riteniamo che i seguenti tre saggi abbiano vantaggi nella definizione dei mutanti della RAF correlati alla malattia: (1) il saggio in vicolo cinsetro che può essere effettuato con facilità per rilevare l’attività catalitica di mutanti RAF attivi15; (2) il saggio di co-attivazione della RAF che è un metodo affidabile e conveniente per misurare l’attività allostricale dei mutanti della RAF ciansioni13,15,21,22,23, 25, (3) il saggio di lucidferasi diviso gratuito che ha una sensibilità molto più elevata nel misurare l’affinità/stabilità relativa dei dimeri dei mutanti RAF in contrasto con il tradizionale analisi di co-immunoprecipitazioni, ed è in grado di svolgere senza attrezzature avanzate in contrasto ai metodi analitici quantitativi come SPR (Surface Plasmon Resonance) analisi15,22. Combinando questi tre saggi, possiamo capire facilmente come un mutante DELLA RAF legato alla malattia alteri la segnalazione a valle e quindi utilizzare una strategia terapeutica appropriata per trattare la malattia causata da questa mutazione della RAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, abbiamo presentato tre metodi per caratterizzare i mutanti RAF correlati alla malattia, che includono il saggio in vitro della chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso gratuito. Dal momento che le chinasi RAF hanno sia attività catalitica che attività allosteric, vari mutanti RAF possono attivare la segnalazione a valle attraverso due meccanismi distinti13,14,16,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere la Hairy Cell Leukemia Fellowship per il supporto di Yuan Jimin. Questo lavoro è stato sostenuto dall’Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), sovvenzione pilota NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) e SHF Academic Medicine Borsa di ricerca (AM/TP011/2018).
Materials
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
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