In dit artikel presenteerden we een reeks praktische en haalbare methoden voor het karakteriseren van ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en complementaire Split plaats assay.
De snel versnelde fibrosarcoma (RAF) familie kinasen spelen een centrale rol in de celbiologie en hun disfunctie leidt tot kankers en ontwikkelingsstoornissen. Een karakterisering van ziekte-gerelateerde RAF mutanten zal ons helpen bij het selecteren van passende therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekten. Recente studies hebben uitgewezen dat de kinasen van de RAF-familie zowel katalytische als allosterische activiteiten hebben, die strak gereguleerd worden door dimerisatie. Hier bouwden we een reeks praktische en haalbare methoden om de katalytische en allosterische activiteiten en de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun mutanten te bepalen. Ten eerste hebben we de klassieke in-vitro kinase assay aangepast door de detergens concentratie in buffers te verminderen, gebruikmakend van een zachte Quick Wash procedure, en het gebruik van een glutathion S-transferase (GST) fusie om te voorkomen dat RAF Dimeren van dissociatie tijdens Zuivering. Dit stelt ons in staat om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten adequaat te meten. Ten tweede ontwikkelden we een roman RAF co-Activation assay om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten te evalueren door gebruik te maken van N-terminale afgeknotte RAF-eiwitten, waardoor de eis van actieve RAS in huidige protocollen wordt geëlimineerd en daardoor een hogere Gevoeligheid. Ten slotte genereerden we een unieke complementaire Split plaats-test om de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van verschillende RAF-mutanten te kwantificeren, wat betrouwbaarder en gevoeliger is in vergelijking met de traditionele Co-Immunoprecipitation-assay. Kortom, deze methoden hebben de volgende voordelen: (1) gebruiksvriendelijk; (2) in staat zijn om effectief te kunnen uitvoeren zonder geavanceerde apparatuur; (3) kosteneffectief; (4) zeer gevoelig en reproduceerbaar.
De RAF familie kinases zijn een belangrijk onderdeel van RAS/RAF/MEK/ERK signalering Cascade, die een signaal van RAS te activeren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MEK)1,2,3,4. Deze familie van kinasen speelt een cruciale rol in celgroei, overleving en differentiatie, en hun veranderingen induceren vele ziekten, met name kanker5,6,7,8. Onlangs hebben genomische sequencings veel ziektegerelateerde RAF-mutanten geïdentificeerd die verschillende eigenschappen vertonen in de signaaloverdracht van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade9,10,11. Een zorgvuldige karakterisering van de mutanten van de RAF zal ons helpen de moleculaire mechanismen te begrijpen van hoe de mutanten van de RAF de signaal output van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade veranderen, en uiteindelijk passende benaderingen selecteren voor de behandeling van verschillende door de RAF gemuteerde ziekten.
De familie van de RAF kinases omvatten drie leden, CRAF, braf, en Araf, die vergelijkbare moleculaire structuren, maar verschillende capaciteiten te activeren downstream signalering1,2,3,4. Onder deze paralogs heeft braf de hoogste activiteit op grond van zijn constitutief gefosforyleerde NTA (N–terminal acidic) motief12,13,14, terwijl Araf de laagste activiteit die voortvloeit uit het niet-canonieke APE motief15. Dit kan verklaren de verschillende mutatie frequenties van RAF paralogs in ziekten: BRAF > CRAF > ARAF. Bovendien, binnen dezelfde RAF Paralog, mutaties in verschillende locaties kunnen leiden tot downstream signalering in verschillende manieren, die voegt een extra laag van complexiteit aan de regulering van de RAF familie kinases. Recente studies hebben aangetoond dat alle RAF kinases zowel de katalytische als de allosterische activiteiten13,14,16,17,18hebben. Constitutief actieve RAF-mutanten zetten de stroomafwaartse signalering rechtstreeks door fosforylating MEK, terwijl kinase-dode RAF-mutanten hun wild type tegenhangers kunnen transactiveren door middel van Side-to-side door dimerisatie en MEK-ERK-signalering16 activeren ,19,20. De dimeer-affiniteit/-stabiliteit is een belangrijke parameter die niet alleen de allosterische activiteit van kinase-dode RAF-mutanten bepaalt, maar ook de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten beïnvloedt,15,21, 22. de kinase-dode RAF mutanten met een hoge dimeer affiniteit/stabiliteit kunnen de endogene wild-type RAFs rechtstreeks transactiveren15, terwijl die met intermediaire dimeer affiniteit/stabiliteit vereist een coördinatie van actieve RAS of een verhoogde niveau van wild-type RAF moleculen om te functioneren13,15,20,21,23. Evenzo, grondwettelijk actieve RAF mutanten fosforylaat MEK in een dimeer-afhankelijke manier, en degenen met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit verliezen hun katalytische activiteit in vitro op immunoprecipitatie die de zwakke RAF Dimeren breekt15, 21,22. De dimeer affiniteit/stabiliteit bepaalt ook de gevoeligheid van de RAF mutanten aan hun remmers, en positief correleert met de weerstand van de RAF-remmers24. Om ziekte-gerelateerde RAF-mutanten te karakteriseren, is het daarom noodzakelijk om hun katalytische en allosterische activiteiten te meten, en dimeer affiniteit/stabiliteit.
In de afgelopen jaren hebben ons laboratorium en anderen verschillende methoden ontwikkeld om RAF familie kinasen en hun mutanten te karakteriseren. Volgens ons laboratorium en de ervaring van anderen, denken we dat de volgende drie assays voordelen hebben bij het bepalen van ziekte-gerelateerde RAF-mutanten: (1) de in vitro kinase assay die gemakkelijk kan worden uitgevoerd om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF mutanten15; (2) de RAF co-Activation assay is een betrouwbare en handige methode om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten13,15,21,22,23, 25; (3) de gratis gesplitste plaats test die een veel hogere gevoeligheid heeft bij het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de mutanten van de RAF in tegenstelling tot de traditionele Co-Immunoprecipitation Assay, en is in staat om uit te voeren zonder geavanceerde apparatuur in contrast met de kwantitatieve analytische methoden zoals SPR (Sppervlakte Plasmon Resonance) analyse15,22. Door deze drie testen te combineren, kunnen we gemakkelijk begrijpen hoe een ziektegerelateerde RAF Mutant de downstream signalering verandert en zo een geschikte therapeutische strategie gebruiken om de ziekte te behandelen die wordt veroorzaakt door deze RAF-mutatie.
In dit artikel presenteerden we drie methoden voor het karakteriseren van de ziekte-gerelateerde RAF mutanten, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en gratis Split plaats assay. Aangezien RAF kinases zowel katalytische activiteit als allosterische activiteit hebben, kunnen verschillende RAF-mutanten de stroomafwaartse signalering activeren via twee verschillende mechanismen13,14,16,<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de Hairy Cell Leukemia Fellowship voor steun van Yuan Jimin erkennen. Dit werk werd gesteund door Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), hertog-NUS Khoo Bridge funding Award (hertog-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging subsidie (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), en SHF academische geneeskunde Onderzoeksbeurs (AM/TP011/2018).
anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |