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Cancer Research

Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

Published: July 17, 2019
doi:
10.3791/59795
, , , , ,
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research,National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program,Duke-NUS Medical School

Summary

En este artículo, presentamos un conjunto de métodos prácticos y factibles para caracterizar mutantes relacionados con enfermedades de quinasas familiares de la RAF, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo complementario de luciferasa dividida.

Abstract

Las quinasas familiares de fibrosarcoma (RAF) aceleradas rápidamente desempeñan un papel central en la biología celular y su disfunción conduce a cánceres y trastornos del desarrollo. Una caracterización de los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad nos ayudará a seleccionar estrategias terapéuticas adecuadas para el tratamiento de estas enfermedades. Estudios recientes han demostrado que las quinasas familiares de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que están estrictamente reguladas por la dmerización. Aquí, construimos un conjunto de métodos prácticos y factibles para determinar las actividades catalíticas y alostéricas y la relativa afinidad/estabilidad de la familia de la RAF y sus mutantes. En primer lugar, modificamos el ensayo clásico de quinasa in vitro reduciendo la concentración de detergente en tampones, utilizando un procedimiento de lavado rápido suave y empleando una fusión de glutatión S-transferasa (GST) para evitar que los dimers de la RAF se disocieran durante Purificación. Esto nos permite medir la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF apropiadamente. En segundo lugar, desarrollamos un nuevo ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa mediante el uso de proteínas de la RAF truncadas en Terminal N, eliminando el requisito de Ras activo en los protocolos actuales y logrando así un mayor Sensibilidad. Por último, generamos un ensayo complementario único de luciferasa dividida para medir cuantitativamente la afinidad/estabilidad relativa de dimer de varios mutantes de la RAF, que es más confiable y sensible en comparación con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación. En resumen, estos métodos tienen las siguientes ventajas: (1) fácil de usar; 2) capaz de llevar a cabo eficazmente sin equipos avanzados; 3) rentable; (4) altamente sensible y reproducible.

Introduction

Las quinasas de la familia RAF son un componente clave de la cascada de señalización RAS/RAF/MEK/ERK, que transmiten una señal de RAS para activar la proteína quinasa activada por mitogeno (MEK)1,2,3,4. Esta familia de quinasas juega un papel crucial en el crecimiento celular, supervivencia ydiferenciación, y sus alteraciones inducen muchas enfermedades, en particular el cáncer 5,6,7,8. Recientemente, las secuenciaciones genómicas han identificado muchos mutantes de la RAF relacionados con enfermedades que exhiben diferentes propiedades en la transmisión de señal de LA cascada RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Una caracterización cuidadosa de los mutantes de la RAF nos ayudará a entender los mecanismos moleculares de cómo los mutantes de la RAF alteran la salida de señal de la cascada RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente seleccionar enfoques apropiados para tratar varias enfermedades impulsadas por mutantes de la RAF.

Las quinasas de la familia RAF incluyen tres miembros, CRAF, BRAF y ARAF, que tienen estructuras moleculares similares pero diferentes capacidades para activar la señalización aguas abajo1,2,3,4. Entre estos paralogs, BRAF tiene la actividad más alta en virtud de su constitutivamente fosforilado NtA (N–terminal a cidic) motivo12,13,14, mientras que ARAF tiene el más bajo actividad derivada de su motivo APE no canónico15. Esto puede explicar las diferentes frecuencias de mutación de los paralogos de la RAF en enfermedades: BRAF>CRAF>ARAF. Además, dentro del mismo paralog de la RAF, las mutaciones en diferentes sitios pueden desencadenar la señalización aguas abajo de maneras distintas, lo que añade otra capa de complejidad a la regulación de las quinasas familiares de la RAF. Estudios recientes han demostrado que todas las quinasas de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas13,14,16,17,18. Los mutantes de la RAF constitutivamente activos activan la señalización aguas abajo directamente mediante el fósforo MEK, mientras que los mutantes de la RAF muertos de quinasa pueden transactivar sus contrapartes de tipo salvaje a través de la dimerización de lado a lado y activar la señalización MEK-ERK16 ,19,20. La afinidad/estabilidad dimer es un parámetro clave que no sólo determina la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa, sino que también afecta a la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF15,21, 22. Los mutantes de la RAF muertos de quinasa con alta afinidad/estabilidad dimer pueden transactivar los RAF endógenos directamente15,mientras que aquellos con afinidad/estabilidad dimer intermedia requiere una coordinación de Ras activo o un nivel elevado de moléculas de tipo salvaje de la RAF para funcionar13,15,20,21,23. Del mismo modo, los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan MEK de una manera dimer-dependiente, y aquellos con baja afinidad/estabilidad dimer pierden su actividad catalítica in vitro tras la inmunoprecipitación que rompe los débiles atenuadores de la RAF15, 21,22. La afinidad/estabilidad dimer también determina la sensibilidad de los mutantes de la RAF a sus inhibidores, y se correlaciona positivamente con la resistencia de los inhibidores de la RAF24. Por lo tanto, para caracterizar a los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, es necesario medir sus actividades catalíticas y alostéricas, y la afinidad/estabilidad del dimer.

En los últimos años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado varios métodos para caracterizar a las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes. Según nuestro laboratorio y la experiencia de otros, creemos que los siguientes tres ensayos tienen ventajas en la definición de mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad: (1) el ensayo de quinasa in vitro que se puede llevar a cabo con facilidad para detectar la actividad catalítica de la mutantes activos de la RAF15; (2) el ensayo de coactivación de la RAF que es un método fiable y conveniente para medir la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa13,15,21,22,23, 25; (3) el ensayo gratuito de luciferasa dividida que tiene una sensibilidad mucho mayor en la medición de la afinidad/estabilidad relativa de los mutantes de la RAF en contraste con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación, y es capaz de llevar a cabo sin equipo avanzado en en contraste con los métodos analíticoscuantitativos como el análisis SPR (S urface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estos tres ensayos, podemos entender fácilmente cómo un mutante de la RAF relacionado con la enfermedad altera la señalización aguas abajo y así utilizar una estrategia terapéutica apropiada para tratar la enfermedad causada por esta mutación de la RAF.

Protocol

1. Ensayo In Vitro Kinase para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF Construir vectores que codifican mutantes de la RAF (Figura1A) con la etiqueta FLAG(DYKDDDDK) en C-terminus mediante el uso de Gibson Assembly o métodos tradicionales de clonación molecular. Introducir la etiqueta FLAG y las mutaciones en las secuencias de codificación de la RAF por PCRs, y luego insertar secuencias enteras en el vector pCDNA3.1(+) utilizando el ens…

Representative Results

Las quinasas de la familia RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que permiten a sus mutantes relacionados con la enfermedad encender la señalización aguas abajo a través de diferentes mecanismos13,14,16,17 ,18. Los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan directamente sus sustratos, mientras que los mutantes de la RAF muertos d…

Discussion

En este artículo, presentamos tres métodos para caracterizar mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo de luciferasa dividida de cortesía. Dado que las quinasas de la RAF tienen actividad catalítica y actividad alostérica, varios mutantes de la RAF pueden activar la señalización aguas abajo a través de dos mecanismos distintos13,14,<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A los autores les gustaría reconocer la Beca de Leucemia de Células Peludas por el apoyo de Yuan Jimin. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Asia Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), Beca de Investigación (AM/TP011/2018).

Materials

anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041
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References

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Keywords: RAF KinaseDisease-related MutantsCharacterizationCatalytic ActivityFlag-taggedGlutathione S-transferase293T CellsLysis BufferAnti-FLAG Affinity BeadsKinase ReactionSDS-PAGEImmunoblot
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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).
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