I den här artikeln presenterade vi en uppsättning praktiska och genomförbara metoder för att karakterisera sjukdomsrelaterade mutanter av RAF-familjekinaser, som inkluderar in vitro-Kinas-analys, RAF-Co-Activation-analys och kompletterande Split luciferas-analys.
Den snabbt accelererade fibrosarkom (RAF) familjen kinaser spelar en central roll i cellbiologi och deras dysfunktion leder till cancer och utvecklingsstörningar. En karakterisering av sjukdomsrelaterade RAF mutanter kommer att hjälpa oss att välja lämpliga terapeutiska strategier för att behandla dessa sjukdomar. Nyligen genomförda studier har visat att RAF familjen kinaser har både katalytiska och Allosteriska aktiviteter, som är tätt reglerade av Dimerization. Här har vi konstruerat en uppsättning av praktiska och genomförbara metoder för att bestämma den katalytiska och Allosteriska verksamheten och den relativa dimeraffinitet/stabiliteten hos RAF-familjekinaser och deras mutanter. För det första har vi ändrat den klassiska in vitro-kinasanalysen genom att minska tvättmedels koncentrationen i buffertar, använda en mild snabb tvätt förfarande och anställa en glutation S-transferas (GST) Fusion för att förhindra att RAF dimerer dissocierar under Rening. Detta gör det möjligt för oss att mäta den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter på lämpligt sätt. För det andra utvecklade vi en roman RAF Co-Activation assay för att utvärdera Alloster aktivitet av Kinas-döda RAF mutanter genom att använda N-Terminal stympade RAF proteiner, vilket eliminerar kravet på aktiva ras i nuvarande protokoll och därmed uppnå en högre Känslighet. Slutligen genererade vi en unik kompletterande Split luciferas assay att kvantitativt mäta den relativa dimer samhörighet/stabilitet olika RAF mutanter, som är mer tillförlitlig och känslig jämfört med den traditionella Co-immunoprecipitation analysen. Sammanfattnings, dessa metoder har följande fördelar: (1) användarvänlig; 2. kunna utföra effektivt utan avancerad utrustning, (3) kostnadseffektivt. (4) mycket känsliga och reproducerbara.
RAF-familjen kinaser är en viktig del av ras/RAF/MEK/erk-signalkaskaden, som sänder en signal från ras för aktivering av mitogenaktiverat proteinkinas (MEK)1,2,3,4. Denna familj av kinaser spelar en avgörande roll i celltillväxt, överlevnad och differentiering, och deras förändringar inducerar många sjukdomar, särskilt cancer5,6,7,8. Nyligen har genomiska sequencings identifierat många sjukdomsrelaterade RAF mutanter som uppvisar olika egenskaper i signalöverföringen av ras/RAF/MEK/erk Cascade9,10,11. En noggrann karakterisering av RAF mutanter kommer att hjälpa oss att förstå de molekylära mekanismerna för hur RAF mutanter förändrar signalen från RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, så småningom välja lämpliga metoder för behandling av olika RAF Mutant-drivna sjukdomar.
RAF familjen kinaser omfatta tre medlemmar, craf, BRAF, och ARAF, som har liknande molekylära strukturer men olika förmågor för att aktivera nedströms signalering1,2,3,4. Bland dessa paralogs har BRAF den högsta aktiviteten på grund av dess konstitutivt fosforylerade nta (N–terminal acidic) motiv12,13,14, medan ARAF har lägst verksamhet som härrör från dess icke-kanoniska apa motiv15. Detta kan förklara de olika Mutations frekvenserna för RAF-paralogs vid sjukdomar: BRAF > CRAF > ARAF. Dessutom, inom samma RAF paralog, mutationer i olika platser kan utlösa nedströms signalering i distinkta sätt, vilket tillför ytterligare ett lager av komplexitet till regleringen av RAF familjen kinaser. Nyligen genomförda studier har visat att alla RAF-kinaser har både katalytisk och allosterisk verksamhet13,14,16,17,18. Konstitutivt aktiva RAF mutanter slå på nedströms signalering direkt av fosforylerande MEK, medan Kinas-döda RAF mutanter kan transaktivera sina Wild-Type motsvarigheter genom sida till sida Dimerization och aktivera MEK-ERK signalering16 ,19,20. Dimeraffinitet/stabilitet är en nyckelparameter som inte bara avgör den Allosteriska aktiviteten hos Kinase-döda RAF-mutanter utan även påverkar den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF-mutanter15,21, 22. den Kinas-döda RAF mutanter med hög dimer samhörighet/stabilitet kan transaktivera endogena vildtyp rafs direkt15, medan de med mellanliggande dimer samhörighet/stabilitet kräver en samordning av aktiva ras eller en förhöjda nivåer av vildtyp RAF-molekyler för att fungera13,15,20,21,23. Likaså, konstitutivt aktiva RAF mutanter fosforylera MEK på ett dimer-beroende sätt, och de med låg dimer affinitet/stabilitet förlorar sin katalytisk aktivitet in vitro-på immunoprecipitation som bryter de svaga RAF dimerer15, 21,22. Den dimer affiniteten/stabiliteten avgör också känsligheten av RAF mutanter till deras inhibitorer, och positivt korrelerar till motståndet av RAF-hämmare24. Därför, för att karakterisera sjukdomsrelaterade RAF mutanter, är det nödvändigt att mäta deras katalytisk och allosterisk verksamhet, och dimer samhörighet/stabilitet.
Under de senaste åren har vårt laboratorium och andra utvecklat olika metoder för att karakterisera RAF-familjekinaser och deras mutanter. Enligt vårt laboratorium och andras erfarenhet, tror vi att följande tre analyser har fördelar med att definiera sjukdomsrelaterade RAF mutanter: (1) in vitro-Kinas analys som kan utföras med lätthet att upptäcka den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter15; (2) Co-aktiveringsanalysen för RAF som är en tillförlitlig och bekväm metod för att mäta den Allosteriska aktiviteten hos Kinase-döda RAF-mutanter13,15,21,22,23, 25. (3) den kostnadsfria Split luciferas-analysen som har mycket högre känslighet vid mätning av den relativa dimeraffiniteten/stabiliteten hos RAF-mutanter i motsats till den traditionella Co-immunoprecipitation-analysen, och som kan utföra utan avancerad utrustning i kvantitativa analytiska metoder såsom spr (surface Plasmon Resonance) analys15,22. Kombinera dessa tre analyser, kan vi förstå lätt hur en sjukdomsrelaterad RAF Mutant förändrar nedströms signalering och därmed utnyttja en lämplig terapeutisk strategi för att behandla den sjukdom som orsakas av denna RAF-mutation.
I denna artikel, presenterade vi tre metoder för att karakterisera sjukdomsrelaterade RAF mutanter, som inkluderar in vitro Kinas assay, RAF Co-Activation assay, och gratis Split luciferas assay. Eftersom RAF-kinaser har både katalytisk aktivitet och allosterisk aktivitet kan olika RAF-mutanter aktivera nedströms signalering genom två distinkta mekanismer13,14,16,17, <sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna Hairy cell leukemi Fellowship för stöd av Yuan Jimin. Detta arbete stöddes av Asien fonden cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge finansiering Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF överbryggande Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) och SHF akademisk medicin Forskningsbidrag (ÄNDR/TP011/2018).
anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |