使用微注射在人赫拉细胞中分体血球定位分析
Summary
乘腔snRNA的生物发生是一个复杂的过程,涉及各种细胞隔间。在这里,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,以监测其在细胞内的传输。
Abstract
乘子鼻核素的生物发生是一个复杂的过程,涉及核和细胞质阶段,最后一步发生在一个称为Cajal体的核隔间中。然而,将snRNA定位到这种亚核结构的序列直到最近才被发现。为了确定在Cajal体内积累snRNA的重要序列,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,然后在其细胞内进行定位。首先,我们准备了snRNA缺失突变体,合成DNA模板进行体外转录,并在UTP与Alexa488相伴的情况下转录snRNA。标记snRNA与70kDa-Dextran与TRITC结合,并微注入到人类HeLa细胞的细胞质。细胞孵育1小时,固定,Cajal身体标记线圈通过间接免疫荧光可视化,而作为核或细胞质注射标志物的snRNA和dextran直接使用荧光显微镜观察。这种方法可以高效、快速地测试各种序列如何影响细胞内的RNA定位。在这里,我们展示 Sm 绑定序列对于将 snRNA 有效定位到 Cajal 体中的重要性。
Introduction
RNA拼接是基因表达的关键步骤之一,基因表达是由一种称为拼接体的大型核糖核蛋白复合物催化的。总共,超过150种蛋白质和5种小核RNA(snRNA)在拼接途径的不同阶段被集成到拼接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA正在参与主要GU-AG的拼接。这些snRNA加入拼接的拼接体作为预形成的小核核核核核核核核核核核核蛋白颗粒(snRNA),含有snRNA,7个Sm蛋白与snRNA(或类似Sm蛋白,与U6 snRNA相关)和1-12个特定蛋白质为每个snRNP。
snRNP 的组装涉及细胞质和核阶段。新转录的snRNA被导出到细胞质中,在那里它获得一个从七种Sm蛋白组装而成的环。Sm环随后充当snRNA重新导入到核的信号。有缺陷的snRNA,不能与Sm蛋白关联,被保留在细胞质1。新进口的snRNPs首先出现在Cajal体内,它们与snRNP特异性蛋白质相遇并完成其成熟(参考文献2,3)。我们最近表明,抑制最终成熟步骤导致在Cajal身体4,5中固存未成熟的snRNPs。我们提出了一个模型,其中最终的snRNP成熟是在质量控制下,监测snRNP特异性蛋白质的添加和活性snRNPs的形成。然而,细胞如何区分正确组装的成熟颗粒和异常未成熟颗粒的分子细节仍然难以捉摸。
为了确定在核Cajal体内靶向和积累snRNA所必需的snRNA序列,我们决定采用荧光标记snRNA的显微注射。微注射是一种选择的方法,因为:1) 它不需要额外的序列标记来区分合成 snRNA 形成其内源性对应物,这对短 RNA 尤其重要,空间很小,无法插入额外的标记序列;2) 它允许分析对生物发生很重要的序列。例如,Sm 序列对于 Sm 环组件和重新导入到原子核6中至关重要。当snRNA在细胞中表达时,缺乏Sm序列的snRNA在细胞质中降解,并且不到达细胞核和Cajal体7。然而,没有Sm序列的snRNA可以直接微注入到细胞核中,从而在Cajal身体定位测定中Sm序列的潜在作用。
在这里,我们详细描述了一种显微注射方法,我们应用这种方法来确定将snRNA靶向Cajal体5所需的snRNA序列。我们表明,Sm 和 SMN 绑定位点是必要和足够的,不仅 snRNA,而且各种短非编码 RNA 到 Cajal 身体。基于显微注射和其他证据,我们提出在Sm绑定位点上组装的Sm环是Cajal体定位信号。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们采用荧光标记snRNA的显微注射来确定对snRNA定位到核Cajal体中的重要序列。由于标签RNA的快速且相当简单制备(通过PCR制备DNA模板,然后进行体外转录),该方法提供了有效分析各种序列如何促进RNA定位。在相对较短的时间内,我们能够分析U2 snRNA的10个不同的删除或替换(参考文献5和未显示的数据)。对于具有复杂生物成因途径的RNA,这种方法还允许对成熟至关重要的测试序列。在snRNA?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了捷克科学基金会(18-10035S)、国家可持续发展方案I(LO1419)、机构支持(RVO68378050)、欧洲区域发展基金(CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775)和赠款机构的支持。查尔斯大学 (GAUK 134516)。我们进一步认可光显微镜核心设施,IMG CAS,捷克共和国布拉格(由赠款支持(捷克生物成像 – LM2015062)。
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
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