Análisis de la localización de ARNS spliceosomal en células hela humanas con microinyección
Summary
La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que involucra varios compartimentos celulares. Aquí, empleamos microinyección de nmRNA etiquetados fluorescentemente con el fin de monitorear su transporte dentro de la célula.
Abstract
La biogénesis de los snRNA spliceosomales es un proceso complejo que implica fases nucleares y citoplasmáticas y el último paso se produce en un compartimiento nuclear llamado cuerpo Cajal. Sin embargo, las secuencias que dirigen la localización de ARN SnRNA en esta estructura subnuclear no se han conocido hasta hace poco. Para determinar secuencias importantes para la acumulación de SnRNAs en cuerpos de Cajal, empleamos microinyección de snRNAs etiquetados fluorescentemente seguido de su localización dentro de las células. Primero, preparamos mutantes de eliminación de SnRNA, sintetizamos plantillas de ADN para transcripción in vitro y snRNAs transcritos en presencia de UTP junto con Alexa488. Los snRNA etiquetados se mezclaron con 70 kDa-Dextran conjugados con TRITC, y microinyectados al núcleo o al citoplasma de células HeLa humanas. Las células fueron incubadas durante 1 h y fijas y la bobina marcadora del cuerpo Cajal fue visualizada por inmunofluorescencia indirecta, mientras que los snRNA y el dextran, que sirve como marcador de inyección nuclear o citoplasmamática, se observaron directamente utilizando un microscopio de fluorescencia. Este método permite realizar pruebas eficientes y rápidas de cómo varias secuencias influyen en la localización del ARN dentro de las células. Aquí, mostramos la importancia de la secuencia de encuadernación Sm para la localización eficiente de los snRNAs en el cuerpo de Cajal.
Introduction
El empalme de ARN es uno de los pasos cruciales en la expresión génica, que es catalizado por un gran complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma. En total, más de 150 proteínas y 5 pequeños ARN nucleares (snRNA) se integran en el espliceosoma en diferentes etapas de la vía de empalme. Los nmarendes U1, U2, U4, U5 y U6 participan en el empalme de los principales intrones GU-AG. Estos snRNAs se unen al spliceosoma como pequeñas partículas de ribonucleoproteína sinformato preformados (snRNPs) que contienen snRNA, siete proteínas Sm asociadas con el ARNs (o proteínas Like-Sm, que se asocian con el ARNS U6) y 1-12 proteínas específicas para cada snRNP.
El montaje de los snRNPs implica etapas citoplasmáticas y nucleares. El ARNN recién transcrito se exporta al citoplasma donde adquiere un anillo ensamblado a partir de siete proteínas Sm. El anillo Sm sirve posteriormente como señal para el ARN SnRNA re-importación de nuevo al núcleo. Los snRNA defectuosos que no se asocian con las proteínas Sm se retienen en el citoplasma1. Los snRNP recién importados aparecen por primera vez en el cuerpo de Cajal, dondese encuentran con proteínas específicas de snRNP y terminan su maduración (revisada en la referencia 2,3). Recientemente mostramos que la inhibición de los pasos finales de maduración resulta en el secuestro de snRNPs inmaduros en cuerpos Cajal4,5. Propusimos un modelo donde la maduración final de snRNP está bajo control de calidad que monitorea la adición de proteínas específicas de snRNP y la formación de snRNPs activos. Sin embargo, los detalles moleculares de cómo las células distinguen entre partículas maduras correctamente ensambladas y aberrantes inmaduras siguen siendo esquivas.
Para determinar las secuencias de ARNQue que son esenciales para la focalización y acumulación de ARNA en cuerpos nucleares de Cajal, decidimos emplear microinyección de snRNA etiquetados fluorescentemente. La microinyección fue un método de elección porque: 1) no requiere una etiqueta de secuencia adicional para distinguir los snRNA sintéticos forman sus homólogos endógenos, lo que es especialmente importante para ARN cortos con poco espacio para la inserción de secuencia de etiquetas adicionales; 2) permite el análisis de secuencias que son importantes para la biogénesis. Por ejemplo, la secuencia Sm es esencial para el montajedel anillo Sm y reimportar en el núcleo 6. Cuando los snRNA se expresan en la célula, los NMNAr que carecen de la secuencia de Sm se degradan en el citoplasma y no alcanzan el núcleo y los cuerpos de Cajal7. Sin embargo, los snRNA sin la secuencia Sm se pueden microinyectar directamente en el núcleo y, por lo tanto, se puede ensayar un papel potencial de la secuencia Sm en la localización del cuerpo de Cajal.
Aquí, describimos en detalle un método de microinyección que aplicamos para determinar las secuencias de ARNS necesarios para apuntar a los NMNm en el cuerpo de Cajal5. Mostramos que los sitios de unión Sm y SMN son juntos necesarios y suficientes para localizar no sólo los ARN de snRNA, sino varios ARN cortos no codificantes en el cuerpo de Cajal. Basándonos en la microinyección, así como en otras pruebas, propusimos que el anillo Sm ensamblado en el sitio de unión Sm sea la señal de localización del cuerpo Cajal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Empleamos microinyección de NMNM con etiqueta fluorescente para determinar secuencias importantes para la localización de ARNEnS en cuerpos nucleares de Cajal. Debido a la preparación rápida y bastante simple de ARN etiquetados (preparación de la plantilla de ADN por PCR seguida de transcripción in vitro), el método ofrece un análisis eficaz de cómo varias secuencias contribuyen a la localización del ARN. En relativamente poco tiempo, pudimos analizar diez eliminaciones o sustituciones diferentes del ARNU U2 (r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Checa de la Ciencia (18-10035S), el Programa Nacional de Sostenibilidad I (LO1419), el apoyo institucional (RVO68378050), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) y la Agencia de Subvenciones de Universidad Charles (GAUK 134516). Además, reconocemos el Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (apoyado por subvenciones (Checo-Bioimagen – LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
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