미세 주입을 사용하여 인간 헬라 세포에서 스플리세오소말 snRNA 국소화 분석
Summary
스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 다양한 세포 구획을 포함하는 복잡한 과정입니다. 여기에서, 우리는 세포 안쪽에 그들의 수송을 감시하기 위하여 형광으로 표지된 snRNAs의 마이크로 주입을 이용했습니다.
Abstract
스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 핵 및 세포질 상과 마지막 단계가 카잘 바디에게 불린 핵 구획에서 생기는 둘 다 관련시키는 복잡한 프로세스입니다. 그러나, 이 비핵화 구조로 snRNA 국소화를 지시하는 서열은 최근까지 알려지지 않았다. Cajal 바디에 있는 snRNAs의 축적을 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여는, 우리는 형광으로 표지된 snRNAs의 미세 주입을 세포 안쪽에 그들의 현지화에 선행했습니다. 첫째, 우리는 snRNA 결실 돌연변이를 준비, 생체 외 전사에 대한 DNA 템플릿을 합성하고 Alexa488와 결합 된 UTP의 존재에 snRNAs를 전사. 표지된 스노르나스를 TRITC와 결합한 70 kDa-Dextran과 혼합하고, 인간 HeLa 세포의 핵 또는 세포질에 미세주입하였다. 세포는 1시간 동안 배양하고 고정하고 카잘 체 마커 코일린을 간접 면역형광에 의해 가시화하였고, 핵 또는 세포질 주입의 마커 역할을 하는 snRNA 및 dextran은 형광 현미경을 사용하여 직접 관찰되었다. 이 방법은 다양한 서열이 세포 내부의 RNA 국소화에 미치는 영향을 효율적이고 신속하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 Cajal 바디로 snRNA의 능률적인 현지화를 위한 Sm 결합 순서의 중요성을 보여줍니다.
Introduction
RNA 접합은 스플리세오좀이라고 불리는 큰 리보뉴클레오단백질 복합체에 의해 촉매되는 유전자 발현의 중요한 단계 중 하나입니다. 총 150개 이상의 단백질과 5개의 작은 핵 RNA(snRNAs)가 접합 경로의 다른 단계에서 스플리세오좀에 통합됩니다. U1, U2, U4, U5 및 U6 snRNAs는 주요 GU-AG 인트론의 접합에 참여하고 있습니다. 이러한 snRNAs는 snRNA, snRNA(또는 U6 snRNA와 연관된 유사 Sm 단백질)와 연관된 7개의 Sm 단백질을 포함하는 미리 형성된 작은 핵 리보핵단백질 입자(snRNPs)와 각 snRNP에 특이적인 1-12개의 단백질로 스플리세오좀을 결합한다.
snRNPs의 집합은 세포질과 핵 단계를 관련시킵니다. 새로 전사된 snRNA는 세포질로 수출되어 7개의 Sm 단백질로부터 조립된 고리를 획득합니다. Sm 링은 이후에 핵으로 다시 수입되는 snRNA에 대한 신호로서 작용한다. Sm 단백질과 연관시키지 못하는 결함이 있는 snRNAs는 세포질1에서 유지됩니다. 새로 수입된 snRNPs는 먼저 snRNP 특이적 단백질을 만나고 그들의 성숙을 완료하는 Cajal바디에서 나타납니다 (참조 2,3에서검토). 우리는 최근에 최종 성숙 단계의 억제가 카잘 바디4,5에있는 미성숙한 snRNPs의 격리 귀착된다는 것을 보여주었습니다 . 우리는 최종 snRNP 성숙이 snRNP 특이적 단백질의 추가 및 활성 snRNPs의 형성을 감시하는 품질 관리의 밑에 있는 모형을 제안했습니다. 그러나, 세포가 정확하게 조립된 성숙한 미성숙한 입자를 구별하는 방법의 분자 세부사항은 애매한 남아 있습니다.
핵 카잘 바디에 있는 snRNA의 표적으로 하고 축적을 위해 필수적인 snRNA 순서를 결정하기 위하여는, 우리는 형광으로 표지된 snRNA의 미세 주입을 채택하기로 결정했습니다. 미세 주주사는 선택의 방법이었다: 1) 합성 snRNAs를 구별하기 위해 추가 서열 태그를 필요로하지 않는 것은 여분의 태그 서열의 삽입을위한 작은 공간과 짧은 RNA에 특히 중요하다 자신의 내인성 대응을 형성; 2) 생물 발생에 중요한 서열을 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, Sm 서열은 SM 링 어셈블리및핵6으로 재가져오기에 필수적이다. snRNAs가 세포에서 발현될 때, Sm 서열이 결여된 snRNAs는 세포질에서 분해되고 핵및 카잘 바디 7에 도달하지 않는다. 그러나, Sm 서열이 없는 snRNAs는 핵 내로 직접 미세주입될 수 있고 따라서 Cajal 체국화에서 Sm 서열의 잠재적인 역할은 분석되었다.
여기서, 우리는 카잘 바디 5로 snRNA를 표적으로 하는 데 필요한 snRNA 서열을결정하기 위하여 적용한 미세 주입 방법을 상세히 기술합니다. Sm및 SMN 바인딩 사이트가 함께 필요하고 snRNA뿐만 아니라 다양한 짧은 비 코딩 RNA를 Cajal 본문에 지역화하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 미세 주입뿐만 아니라 다른 증거에 기초하여, 우리는 SM 결합 부위에 조립 된 SM 링이 Cajal 몸 국소화 신호라고 제안했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 핵 카잘 바디로 snRNA 현지화를 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여 형광표지된 snRNAs의 미세 주입을 이용했습니다. 라벨이 붙은 RNA의 신속하고 다소 간단한 제제로 인해 (PCR에 의한 DNA 템플릿의 준비와 시험관 내 전사) 이 방법은 다양한 서열이 RNA 국소화에 어떻게 기여하는지에 대한 효과적인 분석을 제공합니다. 비교적 짧은 시간에, 우리는 U2 snRNA의 10개의 상이한 삭제 또는 치환을 분석?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 체코 과학 재단 (18-10035S), 국가 지속 가능성 프로그램 I (LO1419), 기관 지원 (RVO68378050), 유럽 지역 개발 기금 (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775)에 의해 지원되었습니다. 찰스 대학 (GAUK 134516). 우리는 또한 빛 현미경 코어 시설, IMG CAS, 프라하, 체코 (보조금에 의해 지원됩니다 (체코 – 바이오 이미징 – LM2015062)를 인정합니다.
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
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