Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione
Summary
La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge vari compartimenti cellulari. Qui, abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per monitorare il loro trasporto all’interno della cellula.
Abstract
La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge fasi nucleari e citoplasmatiche e l’ultimo passo si verifica in un compartimento nucleare chiamato corpo di Cajal. Tuttavia, le sequenze che indirizzano la localizzazione dello snRNA in questa struttura subnucleare non sono note fino a poco tempo fa. Per determinare sequenze importanti per l’accumulo di snRNA nei corpi di Cajal, abbiamo impiegato microiniezione di snRNA fluorescenti etichettati in modo fluorescente seguito dalla loro localizzazione all’interno delle cellule. In primo luogo, abbiamo preparato mutanti di delezione snRNA, sintetizzato modelli di DNA per la trascrizione in vitro e snRNA trascritti in presenza di UTP accoppiati con Alexa488. Gli snRNA etichettati sono stati miscelati con 70 kDa-Dextran coniugati con TRITC, e microiniettati al nucleo o al citoplasma delle cellule umane di HeLa. Le cellule sono state incubate per 1 h e fissa e la bobina del marcatore del corpo di Cajal è stata visualizzata mediante immunoororescenza indiretta, mentre snRNA e dextran, che funge da marcatore di iniezione nucleare o citoplasmica, sono stati osservati direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza. Questo metodo consente di testare in modo efficiente e rapido il modo in cui le varie sequenze influenzano la localizzazione dell’RNA all’interno delle cellule. Qui, mostriamo l’importanza della sequenza di legame Sm per una localizzazione efficiente degli snRNA nel corpo di Cajal.
Introduction
Lo splicing dell’RNA è uno dei passi cruciali nell’espressione genica, catalizzata da un grande complesso di ribonucleoproteina chiamato slicsome. In totale, più di 150 proteine e 5 piccoli RNA nucleari (snRNA) sono integrati nello spliceosome nelle diverse fasi del percorso di giunzione. U1, U2, U4, U5 e U6 snRNA stanno partecipando alla giunzione dei principali introni GU-AG. Questi snRNA si uniscono allo spliceo come piccole particelle di ribonucleoproteina nucleare preformate (snRNP) che contengono snRNA, sette proteine Sm associate allo snRNA (o alle proteine Like-Sm, che si associano allo snRNA U6) e 1-12 proteine specifiche per ogni snRNP.
L’assemblaggio di snRNP comporta stadi citoplasmatici e nucleari. Lo snRNA appena trascritto viene esportato nel citoplasma dove acquisisce un anello assemblato da sette proteine Sm. L’anello Sm successivamente funge da segnale per la reimportazione dello snRNA nel nucleo. Gli snRNA difettosi che non riescono ad associarsi alle proteine Sm vengono conservati nel citoplasma1. Gli snRNP appena importati appaiono per la prima volta nel corpo di Cajal dove incontrano proteine specifiche snRNP e terminano la loro maturazione (rivisto nel riferimento2,3). Recentemente abbiamo dimostrato che l’inibizione delle fasi di maturazione finale si traduce nel sequestro di snRNP immaturi nei corpi di Cajal4,5. Abbiamo proposto un modello in cui la maturazione finale dello snRNP è sotto controllo di qualità che monitora l’aggiunta di proteine specifiche snRNP e la formazione di snRNP attivi. Tuttavia, i dettagli molecolari di come le cellule distinguono tra particelle immature mature e aberranti correttamente assemblate rimangono sfuggenti.
Per determinare le sequenze di snRNA che sono essenziali per il targeting e l’accumulo di snRNA nei corpi nucleari di Cajal, abbiamo deciso di impiegare la microiniezione di snRNA fluorescentmente etichettati. La microiniezione è stato un metodo di scelta perché: 1) non richiede un tag di sequenza aggiuntivo per distinguere gli snRNA sintetici che formano le loro controparti endogene, il che è particolarmente importante per gli RNA brevi con poco spazio per l’inserimento di sequenze di tag extra; 2) permette l’analisi di sequenze che sono importanti per la biogenesi. Ad esempio, la sequenza Sm è essenziale per l’assemblaggio dell’anello Sm e reimportata nel nucleo6. Quando i snRNA sono espressi nella cellula, i snRNA privi della sequenza Sm sono degradati nel citoplasma e non raggiungono il nucleo e i corpi Cajal7. Tuttavia, gli snRNA senza la sequenza Sm possono essere microiniettati direttamente nel nucleo e quindi un potenziale ruolo della sequenza Sm nella localizzazione del corpo di Cajal analizzato.
Qui, descriviamo in dettaglio un metodo di microiniezione che abbiamo applicato per determinare le sequenze snRNA necessarie per indirizzare gli snRNA nel corpo di Cajal5. Abbiamo dimostrato che i siti di legame Sm e SMN sono insieme necessari e sufficienti per localizzare non solo snRNA ma vari RNA brevi non codificanti nel corpo di Cajal. Sulla base di microiniezione e di altre prove, abbiamo proposto che l’anello Sm assemblato sul sito di rilegatura Sm è il segnale di localizzazione del corpo Cajal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per determinare sequenze importanti per la localizzazione del snRNA nei corpi nucleari di Cajal. Grazie alla rapida e piuttosto semplice preparazione degli RNA etichettati (preparazione del modello di DNA da PCR seguita dalla trascrizione in vitro) il metodo offre un’analisi efficace di come le varie sequenze contribuiscono alla localizzazione dell’RNA. In tempi relativamente brevi, siamo stati in grado di analizzare dieci diverse eliminazioni o sostituzioni dello…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Czech Science Foundation (18-10035S), dal National Sustainability Program I (LO1419), dal sostegno istituzionale (RVO68378050), dal Fondo europeo di sviluppo regionale (C..02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) e dall’Agenzia Università Charles (GAUK 134516). Riconosciamo inoltre lo strumento Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Repubblica Ceca (supportato da sovvenzioni (Czech-Bioimaging – LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
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