Analyse av Spliceosomal snRNA lokalisering i Human Hela Cells bruke Microinjection

Summary

Kognitiv av Spliceosomal snRNAs er en kompleks prosess som involverer ulike cellulære rom. Her har vi benyttet microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs for å overvåke deres transport inne i cellen.

Abstract

Kognitiv av Spliceosomal snRNAs er en kompleks prosess som involverer både kjernefysiske og cytoplasmatiske faser, og det siste steget skjer i et kjernefysisk rom kalt Cajal kroppen. Men sekvenser som direkte snRNA lokalisering i denne subnuclear strukturen har ikke vært kjent før nylig. For å finne sekvenser som er viktige for akkumulering av snRNAs i Cajal-organer, brukte vi microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs etterfulgt av deres lokalisering i celler. Først forberedte vi snRNA sletting mutanter, syntetisert DNA maler for in vitro transkripsjon og transkribere snRNAs i nærvær av UTP kombinert med Alexa488. Merket snRNAs ble blandet med 70 kDa-Dextran bøyd med TRITC, og microinjected til kjernen eller cytoplasma av menneskelige HeLa celler. Celler ble inkubert for 1 t og fast og Cajal Body markør Marianne ble sett på av indirekte immunofluorescence, mens snRNAs og dextran, som fungerer som en markør for kjernefysisk eller cytoplasmatiske injeksjon, ble observert direkte ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Denne metoden gjør det mulig for effektiv og rask testing av hvordan ulike sekvenser påvirker RNA lokalisering inne i cellene. Her viser vi viktigheten av SM-bindende sekvens for effektiv lokalisering av snRNAs i Cajal kroppen.

Introduction

RNA skjøting er en av de avgjørende trinnene i genuttrykk, som er katalysert av et stort ribonucleoprotein kompleks kalt spliceosome. Totalt er mer enn 150 proteiner og 5 små kjernefysiske RNAs (snRNAs) integrert i spliceosome på ulike stadier av skjøting veien. U1, U2, U4, U5 og U6 snRNAs deltar i skjøting av store GU-AG introns. Disse snRNAs delta i spliceosome som pre-formet små kjernefysiske ribonucleoprotein partikler (snRNPs) som inneholder snRNA, syv SM proteiner forbundet med snRNA (eller like-SM proteiner, som forbinder med U6 snRNA) og 1-12 proteiner spesifikke for hver snRNP.

Montering av snRNPs innebærer cytoplasmatiske og kjernefysiske stadier. Nylig transkribere snRNA eksporteres til cytoplasma der den får en ring montert fra syv SM proteiner. Den SM ringen senere fungerer som et signal for snRNA re-import tilbake til kjernen. Defekt snRNAs som ikke klarer å assosiere med SM proteiner er beholdt i cytoplasma¹. Nylig importerte snRNPs først vises i Cajal kroppen der de møter snRNP-spesifikke proteiner og fullføre sin modning (gjennomgått i referanse^2,3). Vi har nylig viste at hemming av siste modning trinn resulterer i opptak av umodne snRNPs i Cajal organer^4,5. Vi foreslo en modell der den endelige snRNP modning er under kvalitetskontroll som overvåker tillegg av snRNP-spesifikke proteiner og dannelsen av aktive snRNPs. Men molekylære detaljer om hvordan celler skille mellom riktig montert modne og avvikende umodne partikler forblir unnvikende.

For å bestemme snRNA sekvenser som er avgjørende for målretting og akkumulering av snRNAs i kjernefysiske Cajal organer, bestemte vi oss for å ansette microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs. Microinjection var en metode for valg fordi: 1) det krever ikke en ekstra sekvens kode for å skille syntetiske snRNAs danne sine endogene kolleger som er spesielt viktig for korte RNAs med liten plass for innsetting av ekstra kodesekvens; 2) det tillater analyse av sekvenser som er viktige for kognitiv. For eksempel er SM sekvensen viktig for SM ring montering og re-import til kjernen⁶. Når snRNAs er uttrykt i cellen, snRNAs mangler SM sekvensen er degradert i cytoplasma og ikke nå kjernen og Cajal organer⁷. Men snRNAs uten SM sekvensen kan direkte microinjected inn i kjernen og dermed en potensiell rolle SM sekvensen i Cajal kroppen lokalisering analyseres.

Her beskriver vi i detalj en microinjection metode som vi brukte for å fastslå snRNA-sekvenser som er nødvendige for å målrette snRNAs inn i Cajal-legemet⁵. Vi viste at SM og SMN bindende nettsteder er sammen nødvendig og tilstrekkelig til å lokalisere ikke bare snRNAs men ulike korte ikke-koding RNAs inn i Cajal kroppen. Basert på microinjection så vel som andre bevis, foreslo vi at SM ringen montert på SM bindende området er Cajal kroppen lokalisering signal.

Protocol

1. utarbeidelse av snRNAs for Microinjection Forbered en DNA-mal som inneholder full-lengde eller avkortet/mutert versjon av snRNA av PCR ved hjelp av følgende PCR-oppsett: 98 ° c for 60 s, 98 ° c for 15 s, 68 ° c for 30 s, 72 ° c i 1 min, 98 ° c for 15 s for 35x og 72 ° c i 5 min. Den fremover primer må inneholde en promoter sekvens for in vitro transkripsjon bare oppstrøms av de første transkripsjon nukleotid. Forsterk U2 snRNA sekvens ved å bruke frem primer som inneholder T7 promoter og…

Representative Results

For å overvåke snRNA lokalisering og rollen til SM bindende nettsted i Cajal kroppen målretting, forberedte vi en DNA mal som inneholder T7 promoter og enten full-lengde U2 snRNA eller U2 snRNA mangler de syv nukleotider (AUUUUUG) danner SM bindende området. snRNAs var in vitro skrives, isolert og blandet med TRITC-kombinert dextran-70kDa. Vi microinjected blandingen som inneholder in vitro skrives snRNA inn i kjernen eller cytoplasma av HeLa celler. Det har tidligere blitt vist at SM bind…

Discussion

Vi benyttet microinjection av fluorescensmerkete merket snRNAs å bestemme sekvenser viktig for snRNA lokalisering i kjernefysiske Cajal organer. På grunn av rask og ganske enkel utarbeidelse av merket RNAs (utarbeidelse av DNA mal av PCR etterfulgt av in vitro transkripsjon) metoden gir effektiv analyse av hvordan ulike sekvenser bidra til RNA lokalisering. På relativt kort tid var vi i stand til å analysere ti forskjellige slettinger eller erstatninger av U2-snRNA (referanse⁵ og data ikke vis…

Materials

ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%