Analys av Spliceosomal snRNA lokalisering i mänskliga hela celler med mikroinjektion
Summary
Biogenesis av Spliceosomal snRNAs är en komplicerad process som involverar olika cellulära fack. Här använde vi mikroinjektion av fluorescerande märkta snRNAs för att övervaka deras transport inuti cellen.
Abstract
Biogenesis av Spliceosomal snRNAs är en komplicerad process som involverar både nukleära och cytoplasmiska faser och det sista steget sker i ett kärnkrafts fack kallas Cajal kroppen. Men sekvenser som direkt snRNA lokalisering i denna subnukleära struktur har inte varit känd förrän nyligen. För att bestämma sekvenser som är viktiga för ackumulering av snrnas i Cajal organ, vi anställda görs av överföras märkta snrnas följt av deras lokalisering inuti celler. Först, vi förberedde snRNA radering mutanter, syntetiserade DNA-mallar för in vitro-transkription och transkriberas snRNAs i närvaro av UTP i kombination med Alexa488. Märkta snRNAs blandades med 70 kDa-dextran konjugerat med TRITC, och microinjected till kärnan eller Cytoplasman hos mänskliga HeLa celler. Cellerna inkuberades för 1 h och fixeras och Cajal Body marker Mats visualiserades genom indirekt immunofluorescens, medan snrnas och dextran, som fungerar som en markör för nukleär eller Cytoplasmatisk injektion, observerades direkt med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Denna metod möjliggör effektiv och snabb testning av hur olika sekvenser påverkar RNA lokalisering inuti celler. Här visar vi vikten av den SM-bindande sekvensen för effektiv lokalisering av snRNAs i Cajal kroppen.
Introduction
RNA skarvning är en av de avgörande stegen i genuttryck, som katalyseras av en stor ribonukleoprotein komplex som kallas spliceosome. Sammanlagt är mer än 150 proteiner och 5 små nukleära RNAs (snRNAs) integrerade i skarvar i olika stadier av skarvning vägen. SnRNAs (U1, U2, U4, U5 och U6) deltar i splitsar av stora GU-AG Introns. Dessa snrnas gå med spliceosome som pre-bildade små nukleära ribonukleoprotein partiklar (snrnps) som innehåller snRNA, sju SM proteiner i samband med snRNA (eller liknande-SM proteiner, som associerar med U6 snRNA) och 1-12 proteiner specifika för varje snRNP.
Montering av snRNPs innebär cytoplasmiska och nukleära stadier. Nyligen transkriberade snRNA exporteras till cytoplasman där den förvärvar en ring sammansatt av sju SM-proteiner. SM-ringen fungerar därefter som en signal för snRNA åter importera tillbaka till kärnan. Defekta snRNAs som inte associeras med SM-proteiner behålls i cytoplasman1. Nyligen importerade snrnps visas först i Cajal kroppen där de uppfyller snRNP-specifika proteiner och avsluta sin mognad (ses över i referens2,3). Vi visade nyligen att hämning av den slutliga mogningen steg resulterar i kvarstad på omogen snrnps i Cajal organ4,5. Vi föreslog en modell där den slutliga snRNP mogningen är under kvalitetskontroll som övervakar tillägg av snRNP-specifika proteiner och bildandet av aktiva snRNPs. Men molekylära detaljer om hur celler skilja mellan korrekt monterade mogna och avvikande omogen partiklar förblir svårfångade.
För att bestämma snRNA sekvenser som är viktiga för inriktning och ackumulering av snrnas i nukleära Cajal organ, vi bestämde oss för att anställa mikroinjektion av överföras märkta snrnas. Microinjection var en metod för val eftersom: 1) det kräver inte en ytterligare sekvens tagg för att skilja syntetiska snRNAs bilda sina endogena motsvarigheter som är särskilt viktigt för korta RNAs med liten plats för införande av extra tagg sekvens; 2) det möjliggör analys av sekvenser som är viktiga för biogenes. Till exempel är SM-sekvensen avgörande för SM-ringmontering och återimport till Nucleus6. När snRNAs uttrycks i cellen, är snRNAs saknar SM sekvens bryts ned i cytoplasman och inte når kärnan och Cajal organ7. Men snRNAs utan SM-sekvensen kan direkt mikroinjiceras i kärnan och därmed en potentiell roll i SM-sekvensen i Cajal Body lokalisering analyseras.
Här beskriver vi i detalj en görs metod som vi tillämpade för att bestämma snRNA sekvenser som krävs för att rikta snrnas in i Cajal kroppen5. Vi visade att SM och SMN bindnings platser är tillsammans nödvändiga och tillräckliga för att lokalisera inte bara snRNAs men olika korta icke-kodning RNAs i Cajal kroppen. Baserat på mikroinjektion samt andra bevis, föreslog vi att SM ringen monteras på SM bindningsstället är Cajal kroppen lokalisering signal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi använde mikroinjektion av fluorescerande märkta snRNAs för att bestämma sekvenser viktiga för snRNA lokalisering till nukleära Cajal organ. På grund av snabb och ganska enkel beredning av märkta RNAs (beredning av DNA-mall av PCR följt av in vitro-transkription) metoden erbjuder effektiv analys av hur olika sekvenser bidrar till RNA lokalisering. På relativt kort tid, kunde vi analysera tio olika borttagningar eller substitutioner av U2 snRNA (referens5 och data som inte visas). För …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av tjeckiska vetenskapsstiftelsen (18-10035S), det nationella hållbarhetsprogrammet I (LO1419), institutionellt stöd (RVO68378050), Europeiska regionala utvecklingsfonden (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) och bidrags myndigheten för Karlsuniversitetet (GAUK 134516). Vi erkänner vidare den lätta mikroskopi Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjeckien (med stöd av bidrag (Czech-bioimaging-LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
References
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs – friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
