جيل من المجالات العصبية من الخلايا العصبية خلية فرس النهر الأولية المختلطة والقشرية معزولة عن E14-E16 سبراغ دولي الفئران الجنين
Summary
يقدم هنا بروتوكول للجيل التلقائي من المجالات العصبية المخصب في الخلايا السلف العصبية من الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة. خلال نفس التجربة، عندما يتم طلاء الخلايا العصبية في كثافة أقل، والبروتوكول يؤدي أيضا في الثقافات العصبية الفئران الأولية لفترات طويلة.
Abstract
ثقافة الخلايا العصبية الأولية هي تقنية أساسية في مجال علم الأعصاب. للحصول على رؤى ميكانيكية أعمق في الدماغ، فمن الضروري أن يكون لديك نموذج قوي في المختبر التي يمكن استغلالها لمختلف دراسات علم الأحياء العصبية. على الرغم من أن الثقافات العصبية الأولية (أي، الثقافات فرس النهر على المدى الطويل) قدمت العلماء مع النماذج، فإنه لا يمثل حتى الآن تعقيد شبكة الدماغ تماما. في أعقاب هذه القيود، ظهر نموذج جديد باستخدام المجالات العصبية، والتي تحمل تشابها أوثق إلى أنسجة الدماغ. يصف هذا البروتوكول طلاء الكثافات العالية والمنخفضة من الخلايا العصبية القشرية وفرس النهر المختلطة المعزولة من جنين اليوم الجنيني 14-16 الفئران سبراغ داولي. وهذا يسمح لتوليد المجالات العصبية وثقافة الخلايا العصبية الأولية على المدى الطويل كمنصتين مستقلتين لإجراء مزيد من الدراسات. هذه العملية بسيطة للغاية وفعالة من حيث التكلفة, كما أنه يقلل من عدة خطوات والكواشف تعتبر سابقا ضرورية لثقافة الخلايا العصبية. هذا هو بروتوكول قوي مع الحد الأدنى من المتطلبات التي يمكن تنفيذها مع نتائج قابلة للتحقيق ومزيد من الاستخدام لتنوع الدراسات المتعلقة بعلم الأعصاب.
Introduction
الدماغ هو دوائر معقدة من الخلايا العصبية وغير العصبية. لسنوات، يحاول العلماء الحصول على نظرة ثاقبة في هذه الآلية المعقدة. وللقيام بذلك، لجأ علماء الأعصاب في البداية إلى مختلف خطوط الخلايا القائمة على الأعصاب المحولة لإجراء التحقيقات. ومع ذلك، فإن عدم قدرة هذه الخطوط الخلية clonal لتشكيل اتصالات متشابكة قوية والمحاور المناسبة أو dendrites قد تحولت الاهتمام العلمي إلى الثقافات العصبية الأولية1،2. الجانب الأكثر إثارة من ثقافة الخلايا العصبية الأولية هو أنه يخلق فرصة لمراقبة والتلاعب الخلايا العصبية الحية3. وعلاوة على ذلك، فإنه أقل تعقيدا بالمقارنة مع الأنسجة العصبية، مما يجعلها مرشحا مثاليا لدراسة وظيفة ونقل البروتينات العصبية المختلفة. في الآونة الأخيرة، ولدت العديد من التطورات في مجالات الفحص المجهري، وعلم الجينوم، والبروتيوميات فرصا جديدة لعلماء الأعصاب لاستغلال الثقافات العصبية4.
وقد سمحت الثقافات الأولية لعلماء الأعصاب باستكشاف الآليات الجزيئية وراء التطور العصبي، وتحليل مختلف مسارات الإشارات العصبية، وتطوير فهم أكثر تماسكا لنقاط الاشتباك العصبي. على الرغم من أن عددا من الأساليب قد ذكرت الثقافات من الخلايا العصبية الأولية (معظمها من أصل فرس النهر5و6و7)،بروتوكول موحد مع وسيلة محددة كيميائيا التي تمكن ثقافة طويلة الأجل من الخلايا العصبية هو لا تزال هناك حاجة. ومع ذلك، لوحظت الخلايا العصبية مطلية في كثافة منخفضة في معظم الأحيان، والتي لا البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، على الأرجح بسبب عدم وجود الدعم الغذائي8 التي يتم توفيرها من قبل الخلايا العصبية المجاورة والخلايا الغليفية. وقد اقترحت بعض الأساليب حتى المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الأولية مع الخلايا الدبقية، حيث يتم استخدام الخلايا الدبقية كطبقة مغذية9. ومع ذلك، فإن الخلايا الغليفية تشكل الكثير من المشاكل بسبب فرط نموها، والتي تتجاوز في بعض الأحيان نمو الخلايا العصبية10. وبالتالي، وبالنظر إلى المشاكل المذكورة أعلاه، مطلوب بروتوكول أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة للثقافة العصبية الأولية، والتي يمكن استخدامها من قبل كل من علماء الأحياء العصبية والكيميائيين العصبيين للتحقيقات.
ثقافة الخلايا العصبية الأولية هي أساسا شكل من أشكال الثقافة 2D ولا تمثل اللدونة، والسلامة المكانية، أو عدم تجانس الدماغ. وقد أدى هذا إلى الحاجة إلى نموذج 3D أكثر تصديقا يسمى neurospheres11,12. المجالات العصبية تقدم منصة جديدة لعلماء الأعصاب، مع تشابه أقرب إلى الحقيقي، في الدماغ في الجسم الحي13. المجالات العصبية هي مجموعات ثلاثية الجوانب غير ملتصقة من الخلايا الغنية بالخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، والخلايا السلف العصبية (NPCs)، والخلايا العصبية، والخلايا النجمية. فهي مصدر ممتاز لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف العصبية، والتي يمكن استخدامها لدراسة التمايز في مختلف السلالات العصبية وغير العصبية. ومرة أخرى، يشكل التغير داخل ثقافات الغلاف العصبي المنتجة باستخدام البروتوكولات المبلغ عنها سابقا عائقا أمام صياغة بروتوكول موحد لثقافة الغلاف العصبي14.
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولًا يمكن فيه توليد منصات ثلاثية المدة وثلاثية المدة بالتناوب مع كثافات طلاء الخلايا من ثقافة القشرية وفرس النهر المختلطة. ويلاحظ أنه في غضون 7 أيام يتم الحصول على المجالات العصبية العائمة الحرة من الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة معزولة عن E14-E16 Sprague Dawley الفئران الجنين، والتي على مزيد من الثقافة، وتشكيل الجسور والترابط من خلال ملحقات شعاعي مثل glial. وبالمثل، في الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة، يتم الحصول على ثقافة الخلايا العصبية الأولية التي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 30 يوما عن طريق تغيير وسط الصيانة مرتين في الأسبوع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيف يتم الحصول على اثنين من المنصات العصبية المتغيرة عن طريق تغيير كثافات طلاء الخلايا من الخلايا العصبية الأولية. على الرغم من أن هذا هو أسلوب بسيط، يجب تنفيذ كل خطوة بدقة لتحقيق النتائج المرجوة. وقد أبلغت طرق سابقة أخرى إما على المدى الطويل الثقافات العصبية الأولية أو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مرفق الحيوانات CSIR-IICB. G. D. شكرا ICMR، J. K. و V. G. أشكر DST إلهام، وD. M. شكرا DBT، الهند على زمالاتهم. س. غ. تتكرم بـ “الصرب” (EMR/2015/002230) الهند لتقديمها الدعم المالي.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
