E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi
Summary
Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.
Abstract
Birincil nöron kültürü nörobilim alanında önemli bir tekniktir. Beyne daha derin mekanik anlayışlar elde etmek için, çeşitli nörobiyoloji çalışmaları için istismar edilebilir sağlam bir in vitro modeli olması esastır. Birincil nöron kültürleri (yani, uzun vadeli hipokampal kültürler) modelleri ile bilim adamları sağlamıştır rağmen, henüz tamamen beyin ağının karmaşıklığını temsil etmez. Bu sınırlamaların ardından, beyin dokusuna daha yakın bir benzerlik taşıyan nörosferler kullanılarak yeni bir model ortaya çıkmıştır. Bu protokol, embriyonik gün 14-16 Sprague Dawley sıçanlarının embriyosundan izole edilmiş karışık kortikal ve hipokampal nöronların yüksek ve düşük yoğunluklarının kaplamasını tanımlar. Bu nörosferler ve uzun vadeli birincil nöron kültürünün üretimi için iki bağımsız platformlar olarak daha fazla çalışma yürütmek için izin verir. Bu süreç son derece basit ve uygun maliyetli, birkaç adım ve reaktifler daha önce nöron kültürü için gerekli kabul en aza indirir gibi. Bu, ulaşılabilen sonuçlarla yapIlebilen ve nöroloji ile ilgili çeşitli çalışmalarda daha fazla kullanılabilen en az gereksinime sahip sağlam bir protokoldür.
Introduction
Beyin nöronal ve non-nöronal hücrelerin karmaşık bir devre olduğunu. Yıllardır, bilim adamları bu karmaşık makine hakkında bilgi edinmeye çalışıyorlar. Bunu yapmak için, nörologlar başlangıçta çeşitli dönüştürülmüş sinir tabanlı hücre hatları soruşturmalar için başvurdu. Ancak, güçlü sinaptik bağlantılar ve uygun akson veya dendritler oluşturmak için bu klonal hücre hatlarıyetersizlik birincil nöron kültürleri1bilimsel ilgi kaymıştır1 ,2. Birincil nöron kültürünün en heyecan verici yönü gözlemlemek ve yaşayan nöronları işlemek için bir fırsat oluştururolmasıdır 3. Ayrıca, nöral doku ile karşılaştırıldığında daha az karmaşıktır, hangi fonksiyon ve çeşitli nöronal proteinlerin taşınması için ideal bir aday yapar. Son zamanlarda, mikroskopik, genomik ve proteomik alanlarında çeşitli gelişmeler nöron kültürleri yararlanmak için nörologlar için yeni fırsatlar yarattık4.
Birincil kültürler nörologların nöral gelişimin arkasındaki moleküler mekanizmaları keşfetmelerine, çeşitli sinirsel sinyal yollarını analiz etmelerine ve sinaps hakkında daha tutarlı bir anlayış geliştirmelerine olanak sağlamıştır. Yöntemlerin bir dizi birincil nöronlar kültürleri rapor olmasına rağmen (çoğunlukla hipokampal kökenli5,6,7), nöronların uzun vadeli kültür sağlayan kimyasal olarak tanımlanmış bir orta ile birleşik bir protokol hala gerekli. Ancak, düşük yoğunluklu kaplama nöronlar en sık gözlenir, hangi uzun vadeli hayatta değil, muhtemelen komşu nöronlar ve glial hücreler tarafından sağlanan trofik destek eksikliği nedeniyle8. Bazı yöntemler bile glial hücreleri ile birincil nöronların co-kültüre önerdi, glial hücreler bir besleyici tabaka olarak kullanılan nerede9. Ancak, glial hücreler bazen nöronal büyüme geçersiz kılınan aşırı büyüme nedeniyle bir çok sorun teşkil10. Bu nedenle, yukarıdaki sorunlar göz önüne alındığında, daha basit ve daha uygun maliyetli birincil nöral kültür protokolü gereklidir, hangi araştırmalar için hem nörobiyologlar ve nörokimyacılar tarafından kullanılabilir.
Birincil nöron kültürü aslında 2D kültür biçimidir ve plastisite temsil etmez, mekansal bütünlük, ya da beynin heterojenlik. Bu nörosferler denilen daha inandırıcı bir 3D modeli için ihtiyaç doğurdu11,12. Nörosferler nörologlar için yeni bir platform mevcut, gerçek daha yakın bir benzerlik ile, in vivo beyin13. Nörosferler nöral kök hücreler (NSCs), nöral progenitor hücreleri (NPCs), nöronlar ve astrositler açısından zengin olan non-adherent 3D hücre kümeleridir. Onlar nöral kök hücreleri ve nöral progenitor hücrelerinizolasyon için mükemmel bir kaynak, çeşitli nöronal ve non-nöronal soylara farklılaşma çalışma için kullanılabilir. Yine, daha önce bildirilen protokoller kullanılarak üretilen nörosfer kültürleri içinde değişkenlik birleşik bir nörosfer kültür protokolü formülasyonu için bir engel sunuyor14.
Bu el yazması, karışık kortikal ve hipokampal kültürden hücre kaplama yoğunluklarını değiştirerek hem 2D hem de 3Boyutlu platformlar oluşturmanın mümkün olduğu bir protokol sunar. 7 gün içinde serbest yüzen nörosferlerin E14-E16 Sprague Dawley sıçan embriyosundan izole edilen yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan elde edildiği ve daha fazla kültür üzerine radyal glial benzeri uzantılar aracılığıyla köprüler ve ara bağlantılar oluşturduğu gözlenmiştir. Benzer şekilde, düşük yoğunluklu kaplama nöronlarda, haftada iki kez bakım ortamı değiştirilerek 30 güne kadar muhafaza edilebilen birincil nöron kültürü elde edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, primer nöronların hücre kaplama yoğunluklarını değiştirerek iki değişken nöronal platformun nasıl elde edildiğini açıklar. Bu basit bir yöntem olmasına rağmen, istenilen sonuçları elde etmek için her adım titizlikle yapılmalıdır. Diğer önceki yöntemler ya uzun vadeli primer nöron kültürleri veya nörosfer kültürleri bildirilmiştir. En birincil nöron kültür protokolleri için hipokampal nöronların kültürdahil 3-5 hafta, ama çoğu başarısız oldu, nöronlar ölmek ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CSIR-IICB hayvan tesisine teşekkür ederiz. G. D. teşekkür ICMR, J. K. ve V. G. teşekkür DST Inspire, ve D. M. teşekkür DBT, Hindistan onların burs için. S. G. mali destek sağladığı için Serb (EMR/2015/002230) Hindistan’ı kabul eder.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
