Summary

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

Published: August 31, 2019
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Summary

ここに提示されるのは、高密度めっきニューロンから神経前駆細胞に濃縮された神経球の自発的生成のためのプロトコルである。同じ実験の間に、ニューロンが低密度でめっきされるとき、プロトコルはまた、長期の一次ラットニューロン培養をもたらす。

Abstract

一次ニューロン培養は神経科学の分野で不可欠な技術です。脳に深い機械的洞察を得るためには、様々な神経生物学の研究に利用できる堅牢なインビトロモデルを持つことが不可欠です。一次ニューロン培養(すなわち、長期的な海馬培養)は、科学者にモデルを提供してきましたが、脳ネットワークの複雑さを完全に表しているわけではありません。これらの制限をきっかけに、脳組織に近い神経球を用いた新しいモデルが出現した。本プロトコルは、胚の胚から分離された皮質ニューロンと海馬ニューロンの高密度および低密度のめっきを記述する14-16スプラーグドーリーラットである。これにより、神経圏および長期の一次ニューロン培養の生成を2つの独立したプラットフォームとして、さらなる研究を行うことが可能となる。このプロセスは、ニューロン培養に不可欠と考えられていたいくつかのステップと試薬を最小限に抑えるため、非常にシンプルで費用対効果が高い。これは達成可能な結果で行うことができ、さらに神経科学に関連する研究の多様性のために使用することができる最小限の要件で堅牢なプロトコルです。

Introduction

脳は、神経細胞と非神経細胞の複雑な回路です。何年もの間、科学者たちはこの複雑な機械に関する洞察を得ようとしてきた。そのために、神経科学者は当初、調査のために様々な形質転換神経系細胞株に頼った。しかし、これらのクローン細胞株が強いシナプス結合および適切な軸線またはデンドライトを形成できないことは、科学的関心を一次ニューロン培養1、2にシフトさせた。一次ニューロン培養の最もエキサイティングな側面は、生きているニューロン3を観察し、操作する機会を作り出すことです。また、神経組織に比べて複雑性が低いため、様々な神経タンパク質の機能や輸送を研究するのに理想的な候補です。近年、顕微鏡、ゲノミクス、プロテオミクスの分野でいくつかの発展が起きており、神経科学者がニューロン培養を利用する新たな機会を生み出しています4。

一次培養により、神経科学者は神経発達の背後にある分子機構を探索し、様々な神経シグナル伝達経路を解析し、シナプスのより一貫した理解を開発することができました。多くの方法が一次ニューロン(主に海馬起源5、6、7から)からの培養を報告しているが、ニューロンの長期培養を可能にする化学的に定義された媒体を持つ統一プロトコルは、まだ必要です。しかし、低密度でめっきされたニューロンは、最も頻繁に観察され、これは長期的に生き残るものではなく、隣接するニューロンおよびグリア細胞によって提供される栄養支持体8の欠如に起因する可能性が高い。いくつかの方法は、グリア細胞とグリア細胞との一次ニューロンの共培養を示唆しています, ここでグリア細胞は、フィーダー層9として使用されています.しかし、グリア細胞は過剰増殖に起因する多くの問題を提起し、時には神経成長10を上書きする。したがって、上記の問題を考慮すると、より簡単で費用対効果の高い一次神経培養プロトコルが必要であり、これは神経生物学者と神経化学者の両方が調査に使用することができる。

一次ニューロン培養は本質的に2D培養の一形態であり、脳の可塑性、空間的完全性、または不均一性を表すものではありません。これは、神経球11、12と呼ばれるより信じられる3Dモデルの必要性を生み出しました。神経球は、生体内脳13において、実際に類似した新しいプラットフォームを神経科学者に提示する。神経球は、神経幹細胞(NSC)、神経前駆細胞(NPC)、ニューロン、および星状細胞が豊富な細胞の非付着性3Dクラスターです。それらは神経幹細胞および神経前駆細胞の単離のための優秀な源であり、様々な神経系および非神経系統への分化を研究するために使用することができる。繰り返しになりますが、以前に報告されたプロトコルを用いて産生される神経球培養内の変動性は、統一された神経球培養プロトコル14の定式化に対する障壁を提示する。

この原稿は、混合皮質および海馬培養から細胞めっき密度を交互にすることによって、2Dおよび3Dプラットフォームの両方を生成することができるプロトコルを提示する。自由浮遊神経球は、E14-E16スプラーグドーリーラット胚から単離された高密度めっきニューロンから7日以内に得られ、さらなる培養時に、放射状グリア状の拡張を介してブリッジと相互接続を形成する。同様に、低密度めっきニューロンでは、週2回維持培地を変更して最大30日間維持できる一次ニューロン培養が得られる。

Protocol

動物に関するすべての実験手順は、CSIR-インド化学生物学研究所の機関動物倫理委員会(IICB/AEC/ミーティング/2018/1)によって承認されました。 1. 試薬およびメディアの準備 ポリD-リジン(PDL)溶液:脱イオン水中で0.1mg/mLの濃度でPDL溶液を調製し、使用するまで4°Cに保存します。 解離培地:無菌、濾過脱イオン水の1Lに、塩化ナトリウム(8mg/mL)、塩化カリウム(0.4mg/…

Representative Results

このプロトコルでは、2つの異なる神経スクリーニングプラットフォームから可変細胞めっき密度が得られるという簡単な戦略が解明されている。図1Aは、Bがそれぞれ高密度及び低密度メッキ細胞におけるニューロンをめっきした4時間後の細胞の付着を示す。図1に示すようにニューロンの適切な付着を観察す?…

Discussion

このプロトコルは、一次ニューロンの細胞めっき密度を変化させ、2つの可変ニューロンプラットフォームが得られる方法を説明する。これは簡単な方法ですが、目的の結果を得るには、各ステップを細心の注意を払って実行する必要があります。他の以前の方法は、長期の一次ニューロン培養または神経球培養を報告しています。.ほとんどの一次ニューロン培養プロトコルは、3〜5週間海馬…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CSIR-IICB動物施設に感謝します。G. D. 感謝 ICMR, J. K. と V. G. DST インスパイアに感謝し、D. M. 彼らのフェローシップのために DBT に感謝します。S.G.は、インドのSERB(EMR/2015/002230)が財政支援を行った場合に認める。

Materials

Anti-GFAP Abcam AB7260
Anti- Nestin Abcam AB92391
Anti-O4 Millipore MAB345
Anti-Tau Abcam AB76128
Anti-Tuj1 Millipore MAB1637
B27 Serum Free Supplement  Gibco 17504-044
Cell Counter Life technologies Countess II FL
CO2 Incubator Eppendorf Galaxy 170 R
D-glucose  SDFCL 38450-K05
Ethanol Merck Millipore 100983
Fluorescence Microscope Olympus IX83 Model
Formaldehyde Sigma Aldrich 47608
GlutaMax-I Supplement Gibco 35050-061
GtXMs IgG Fluor Millipore AP1814
GtXMs IgG (H+L) Millipore AP124C
HEPES SRL 16826
Hoechst 33258 Calbiochem 382061
Horse Serum  HiMedia RM10674
Hydrochloric Acid Rankem H0100
Laminar Hood BioBase BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS  Sigma Aldrich M-2279
Microscope Dewinter Victory Model
Neurobasal Medium  Gibco 21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) BD Falcon 353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes Himedia PW001
Penicillin/Streptomycin  Gibco 15140-122
Poly-D-Lysine Millipore A.003.E
Potassium Chloride  Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic  Merck MI6M562401
Sodium Chloride  Qualigem 15918
Sodium Phosphate Dibasic  Merck MI6M562328
Stereomicrosope Dewinter Zoomstar Model
Triton-X 100 SRL 2020130
Trypan Blue Solution Gibco 15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA Gibco 25200-072

References

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Das, G., Gupta, V., Khan, J., Mukherjee, D., Ghosh, S. Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo. J. Vis. Exp. (150), e59800, doi:10.3791/59800 (2019).

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