Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo
Summary
Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.
Abstract
La cultura primaria dei neuroni è una tecnica essenziale nel campo delle neuroscienze. Per ottenere approfondimenti meccanicistici nel cervello, è essenziale avere un robusto modello in vitro che può essere sfruttato per vari studi di neurobiologia. Anche se le colture neuronali primarie (cioè le colture ippocampali a lungo termine) hanno fornito agli scienziati modelli, non rappresentano ancora completamente la complessità della rete cerebrale. Sulla scia di queste limitazioni, è emerso un nuovo modello usando le neurosfere, che assomiglia più in sé al tessuto cerebrale. Il presente protocollo descrive la placcatura di densità alte e basse di neuroni corticali e ippocampali misti isolati dall’embrione dei ratti Sprague Dawley del giorno embrionale 14-16. Questo permette per la generazione di neurosfere e la cultura dei neuroni primari a lungo termine come due piattaforme indipendenti per condurre ulteriori studi. Questo processo è estremamente semplice e conveniente, in quanto riduce al minimo diversi passaggi e reagenti precedentemente ritenuti essenziali per la coltura dei neuroni. Questo è un protocollo robusto con requisiti minimi che possono essere eseguiti con risultati raggiungibili e ulteriormente utilizzati per una varietà di studi relativi alle neuroscienze.
Introduction
Il cervello è un intricato circuito delle cellule neuronali e non neuronali. Per anni, gli scienziati hanno cercato di ottenere informazioni su questo complesso meccanismo. Per farlo, i neuroscienziati inizialmente hanno fatto ricorso a varie linee cellulari basate sui nervi trasformate per le indagini. Tuttavia, l’incapacità di queste linee cellulari clonali di formare forti connessioni sinaptiche e assoni o dendriti adeguati ha spostato l’interesse scientifico alle colture neuronali primarie1,2. L’aspetto più eccitante della cultura neuronale primaria è che crea l’opportunità di osservare e manipolare i neuroni viventi3. Inoltre, è meno complesso rispetto al tessuto neurale, che lo rende un candidato ideale per studiare la funzione e il trasporto di varie proteine neuronali. Recentemente, diversi sviluppi nei campi della microscopia, genomica e proteomica hanno generato nuove opportunità per i neuroscienziati di sfruttare le colture neuronali4.
Le culture primarie hanno permesso ai neuroscienziati di esplorare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo neurale, analizzare vari percorsi di segnalazione neurale e sviluppare una comprensione più coerente della sinapsi. Anche se un certo numero di metodi hanno segnalato colture da neuroni primari (per lo più dall’origine ippocampale5,6,7), un protocollo unificato con un mezzo definito chimicamente che consente la coltura a lungo termine dei neuroni è ancora necessario. Tuttavia, neuroni placcati a bassa densità sono più spesso osservati, che non sopravvivono a lungo termine, probabilmente a causa della mancanza di supporto trofico8 che è fornito dai neuroni adiacenti e cellule gliali. Alcuni metodi hanno anche suggerito la cocoltura dei neuroni primari con cellule gliali, in cui le cellule gliali vengono utilizzate come strato di alimentazione9. Tuttavia, le cellule gliali pongono un sacco di problemi a causa della loro crescita eccessiva, che a volte sostituiscono la crescita neuronale10. Quindi, considerando i problemi di cui sopra, è necessario un protocollo di coltura neurale primaria più semplice e più conveniente, che può essere utilizzato sia dai neurobiologi che dai neurochimici per le indagini.
Una cultura neuronale primaria è essenzialmente una forma di cultura 2D e non rappresenta la plasticità, l’integrità spaziale o l’eterogeneità del cervello. Questo ha dato origine alla necessità di un modello 3D più credibile chiamato neurosfere11,12. Le neurosfere presentano una nuova piattaforma per i neuroscienziati, con una somiglianza più stretta con il vero cervello in vivo13. Le neurosfere sono cluster 3D non aderenti di cellule ricche di cellule staminali neurali (NSC), cellule progenitrici neurali (NPC), neuroni e astrociti. Sono un’ottima fonte per l’isolamento delle cellule staminali neurali e delle cellule progenitrici neurali, che possono essere utilizzate per studiare la differenziazione in varie linee neuronali e non neuronali. Ancora una volta, la variabilità all’interno delle culture della neurosfera prodotte utilizzando i protocolli precedentemente riportati presenta una barriera alla formulazione di un protocollo di coltura della neurosfera unificata14.
Questo manoscritto presenta un protocollo in cui è possibile generare piattaforme 2D e 3D alternando densità di placcatura cellulare da una coltura misa corticale e ippocampale. Si osserva che entro 7 giorni le neurosfere fluttuanti sono ottenute da neuroni placcati ad alta densità isolati dall’embrione di ratto E14-E16 Sprague Dawley, che su ulteriore cultura, formano ponti e interconnessioni attraverso estensioni radiali simili agli gliali. Allo stesso modo, nei neuroni placcati a bassa densità, una coltura neuronale primaria che può essere mantenuta fino a 30 giorni si ottiene cambiando il mezzo di manutenzione due volte alla settimana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive che come alterando la densità di placcatura cellulare dei neuroni primari, si ottengono due piattaforme neuronali variabili. Anche se questo è un metodo semplice, ogni passo deve essere eseguita meticolosamente per ottenere i risultati desiderati. Altri metodi precedenti hanno segnalato colture di neuroni primari a lungo termine o culture della neurosfera. La maggior parte dei protocolli di coltura neuronale primaria hanno coinvolto la coltura dei neuroni ippocampali per 3-5 settimane, ma la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’impianto per animali CSIR-IICB. G. D. ringrazia ICMR, J. K. e V. G. ringraziano DST Inspire, e D. M. ringrazia NOT, India per le loro borse di studio. S. G. riconosce gentilmente seRB (EMR/2015/002230) India per fornire sostegno finanziario.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
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