Generering av Neurospheres fra Mixed Primary hippocampus og kortikale neurons isolert fra E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Summary

Presentert her er en protokoll for den spontane generasjonen av neurospheres beriket i nevrale stamceller fra høy tetthet belagt neurons. Under samme eksperiment, når neurons er belagt med en lavere tetthet, resulterer protokollen også i forlenget primære rotte Nevron kulturer.

Abstract

Primær Nevron kultur er en viktig teknikk innen nevrovitenskap. For å få dypere mekanistisk innsikt i hjernen, er det viktig å ha en robust in vitro-modell som kan utnyttes til ulike nevrobiologi studier. Selv om primære Nevron kulturer (dvs. langsiktige hippocampus kulturer) har gitt forskere med modeller, betyr det ennå ikke representerer kompleksiteten i hjernen nettverket helt. I kjølvannet av disse begrensningene, har en ny modell dukket opp ved hjelp av neurospheres, som bærer en nærmere likhet med hjernevevet. Den nåværende protokollen beskriver plating av høy og lav tetthet av blandede kortikale og hippocampus neurons isolert fra fosteret av embryonale dagen 14-16 Sprague Dawley rotter. Dette gjør det mulig for generering av neurospheres og langsiktige primære Nevron kultur som to uavhengige plattformer for å gjennomføre videre studier. Denne prosessen er svært enkel og kostnadseffektiv, da det minimerer flere trinn og reagenser tidligere anses avgjørende for Nevron kultur. Dette er en robust protokoll med minimale krav som kan utføres med oppnåelige resultater og videre brukes til et mangfold av studier knyttet til nevrovitenskap.

Introduction

Hjernen er en intrikat krets av neuronal og ikke-neuronal celler. I årevis har forskere blitt prøver å få innsikt i dette komplekse maskiner. For å gjøre dette, nevrologer i utgangspunktet til ulike forvandlet nerve-baserte cellelinjer for undersøkelser. Imidlertid har manglende evne til disse klonal cellelinjer til å danne sterke Synaptic tilkoblinger og riktig axons eller dendrites skiftet vitenskapelig interesse for primær Nevron kulturer^1,2. Det mest spennende aspektet ved primær Nevron kultur er at det skaper en mulighet til å observere og manipulere levende neurons³. Videre er det mindre komplekst i forhold til nevrale vev, som gjør det til en ideell kandidat for å studere funksjon og transport av ulike neuronal proteiner. Nylig har flere utbygginger innen mikroskopi, Genomics og Proteomikk generert nye muligheter for nevrologer å utnytte Nevron kulturer⁴.

Primær kulturer har tillatt nevrologer å utforske den molekylære mekanismer bak neural utvikling, analysere ulike nevrale signalering trasé, og utvikle en mer helhetlig forståelse av synapsis. Selv om en rekke metoder har rapportert kulturer fra primære neurons (hovedsakelig fra hippocampus opprinnelse^5,6,7), en enhetlig protokoll med et kjemisk definert medium som muliggjør langsiktig kultur neurons er fortsatt nødvendig. Men, neurons belagt på en lav tetthet er oftest observert, som ikke overlever langsiktig, sannsynligvis på grunn av mangel på trofiske støtte⁸ som er gitt av tilstøtende neurons og gliacellene celler. Noen metoder har selv antydet co-dyrking av de primære neurons med gliacellene celler, karakterisert ved at de gliacellene cellene brukes som en mater lag⁹. Men gliacellene celler utgjør en masse problemer på grunn av deres overvekst, som noen ganger overstyre neuronal vekst¹⁰. Derfor, med tanke på problemene ovenfor, en enklere og mer kostnadseffektiv primære neural kultur protokollen er nødvendig, som kan brukes av både neurobiologists og neurochemists for undersøkelser.

En primær Nevron kulturen er egentlig en form for 2D kultur og representerer ikke plastisitet, romlig integritet, eller heterogenitet av hjernen. Dette har gitt opphav til behovet for en mer troverdig 3D-modell som heter neurospheres^11,12. Neurospheres presentere en ny plattform til nevrologer, med en nærmere likhet med den virkelige, in vivo hjernen¹³. Neurospheres er ikke-tilhenger 3D-klynger av celler som er rike på nevrale stamceller (NSCs), nevrale stamceller (NPCer), neurons, og astrocytter. De er en utmerket kilde for isolering av nevrale stamceller og nevrale stamceller, som kan brukes til å studere differensiering inn i ulike neuronal og ikke-neuronal linjene. Igjen, variasjoner innen neurosphere kulturer produsert ved hjelp av tidligere rapporterte protokoller presenterer en barriere for utformingen av en enhetlig neurosphere kultur protokoll¹⁴.

Dette manuskriptet presenterer en protokoll der det er mulig å generere både 2D-og 3D-plattformer av vekslende celle plating tetthet fra en blandet kortikale og hippocampus kultur. Det er observert at innen 7 dager fritt flytende neurospheres er innhentet fra høy tetthet belagt neurons isolert fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo, som ved videre kultur, danner broer og sammenkoblinger gjennom radial gliacellene-lignende utvidelser. Tilsvarende i lav tetthet belagt neurons, en primær Nevron kultur som kan opprettholdes i opptil 30 dager oppnås ved å endre vedlikehold medium to ganger per uke.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av den institusjonelle dyreetikk komité CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/møte/APR/2018/1). 1. forberedelse av reagens og medier Løsning for Poly-D-lysin (PDL): klargjør PDL-løsninger ved konsentrasjoner av 0,1 mg/mL i deionisert vann og oppbevares i 4 ° c til bruk. Dissosiasjon medium: til 1 L sterilt, filtrert deionisert vann, Kombiner følgende komponenter i de respektive konsentrasjo…

Representative Results

I denne protokollen, en enkel strategi har vært belyst der variabel celle plating tettheten fra to forskjellige nevrale screening plattformer er innhentet. Figur 1a,B illustrerer overholdelse av celler etter 4 h av plating neurons i høy og lav tetthet belagt celler, henholdsvis. På observere riktig overholdelse av neurons som vist i figur 1, ble plating medium erstattet av vedlikeholds medium i hver av brønne…

Discussion

Denne protokollen beskriver at hvordan ved å endre celle plating tettheten av primære neurons, to variable neuronal plattformer er innhentet. Selv om dette er en enkel metode, må hvert trinn utføres omhyggelig for å oppnå de ønskede resultatene. Andre tidligere metoder har enten rapportert langsiktige primære Nevron kulturer eller neurosphere kulturer. Mest primære Nevron kultur protokoller har involvert dyrking av hippocampus neurons for 3-5 uker, men de fleste har sviktet, som neurons dø og visne bort på gru…

Materials

Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072