Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.
Abstract
Derivar a haste hematopoietic funcional e as pilhas do progenitor (hspcs) das pilhas de haste pluripotentes humanas (PSCs) têm sido um objetivo indescritível para transplantações autólogos tratar desordens hematológicas e malignos. O endotélio hemogênico (HE) é uma plataforma amativa para produzir HSPCs funcionais por fatores de transcrição ou para induzir linfócitos de forma robusta. No entanto, os métodos atuais para derivar HE são caros ou variáveis no rendimento. Neste protocolo, nós estabelecemos um método cost-effective e preciso para derivar o HE dentro de 4 dias em uma condição definida alimentador-e Xeno-livre. O He resultante submeteu-se a uma transição endotelial-à-hematopoietic e produziu progenitores hematopoietic de CD34+CD45+ ensaios. A capacidade potencial de nossa plataforma para gerar HSPCs funcionais terá aplicações amplas na modelagem e na seleção da doença para compostos terapêuticos.
Introduction
O desenvolvimento de novas terapêuticas para distúrbios hematológicos e imunológicos tem sido dificultado pela falta de plataformas robustas para modelagem de doenças e triagem de medicamentos de alta taxa de transferência com células-tronco hematopoiéticas autólogas (HSCs) derivadas de pacientes células-tronco pluripotentes (PSCs). O avanço da tecnologia induzida (i) PSC tem a promessa de modelar doenças das células dos pacientes, mas o estabelecimento de HSCs funcionais de iPSCs paciente tem sido elusivo. A fim derivar hscs dos PSCs humanos, a indução apropriada de padronização e de programas transcricional embrionário é chave1,2,3,4,5,6, 7,8. O progresso recente no desenvolvimento hematopoiético demonstrou o papel do endotélio hemogênico (HE) no desenvolvimento do HSC9. Pode ser induzido de PSCs e é passíveis à intervenção a jusante tal como a transferência10,11,12,13do gene. Usando o He como uma plataforma, a combinação de 5 fatores de transcrição (ERG, HOXA5, HOXA9, lcor, RUNX1) induziu com sucesso hscs funcionais que enxertia a longo prazo e se diferenciam em linhagens múltiplas14. No entanto, a geração variável e ineficiente de HE de PSCs dificultou a manipulação sistemática e a análise das células, juntamente com a produção em prateleira e a indução em larga escala de células hematopoiéticas para uso clínico.
Aqui, nós descrevemos um método cost-effective e preciso para derivar o HE em 4 dias com uma condição definida alimentador-e Xeno-livre. Neste método, a formação de esferóide e o re-aplaamento espontâneo no imarix-511 asseguram uma densidade consistente de colônias do PSC, que é crucial para a indução eficiente de pilhas de He.
Protocol
1. reagentes
- Linhas celulares (PSCs humanos): obter células-tronco embrionárias (ESCs) ou linhas iPSC 409B2 e 201B7 (317-9)) e CBA11.
-
Preparação do reagente
- Meio do chapeamento do PSC: meio da manutenção do PSC da mistura com 10 μM Y-27632 e armazene em 4 ° c.
- PSC spheroid azulejos Medium: Mix PSC manutenção meio com 625 – 1250 ng/ml recombinante humano laminina-511 E8 fragmento (LM511-E8) (dependendo da linha celular) pouco antes de usar.
Nota: LM511-E8 pode ser misturado na mídia15. A outra matriz tal como o laminin-511 full-length precisa de ser pre-coated, e mesmo fêz assim, não sustentam os organóides mesodérmicos aderiram durante o processo da diferenciação. - Meio de diferenciação do dia 0: Misture o meio basal Mesodérmico com 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL Proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) e 80 ng/ml fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).
- Meio de diferenciação do dia 2: Misture o meio basal Hemogênico com 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF e 100 ng/mL fator de células-tronco (SCF).
- Prepare o tampão fosfato salina (PBS) sem cálcio ou magnésio (ver tabela de materiais).
- 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) tampão: adicionar 1 mL de 0,5 M EDTA a 500 mL de PBS.
- EHT médio: Mix hematopoiéticos médio basal com 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml de thrombopoietin (TPO), 50 ng/ml FMS-Related tirosina quinase 3 ligante (FLT-3L), 20 ng/ml interleucina-6/interleukin-6 receptor Alpha (IL-6/Il-6rα), insulina-transferrina-selênio-etanolamina, L-glutamina e penicilina/estreptomicina/Ampfotericina B.
- Tampão de FACS: Misture o PBS com o soro fetal da vitela de 2% e o EDTA de 1 milímetro.
- Prepare a reserva de separação magnética (ver tabela de materiais).
- Prepare a mídia à base de metilcelulose (ver tabela de materiais).
2. formação da colônia do PSC
- Cresça hPSCs para 70 – 80% de confluência em uma placa de 6 poços de 0,5 μg cm-2 LM511-E8-revestido em mTeSR1 em uma incubadora de 37 ° c com 5% de co2.
-
Dissociação do PSC (dia-4)
- Aspirar o meio e lavar as células com PBS duas vezes. Enxague as células com solução de dissociação. Incubar a 37 ° c durante 15 min (as células não se dessecarão neste momento).
- Suspender as células no meio de manutenção PSC, transferir a suspensão para um tubo de tamanho adequado e centrifugar as células em 200 x g por 3 min. aspirar o sobrenadante e suspender as células no meio de chapeamento PSC.
- Placa a suspensão PSC a uma densidade de 48.000 – 70.000 células cm-2 (dependendo da linha celular) em uma embarcação plástica microfabricada e incubar durante a noite na incubadora de 37 ° c com 5% co2.
Nota: Nós recomendamos 100 μL bem-1 da suspensão da pilha em uma embarcação plástica micro-fabricada 96-well. Você normalmente vai semente 20.000 células bem-1 em uma placa 96-bem para produzir cerca de 100 spheroids. -
Tiling esferoides PSC em LM511-E8 (Dia-3)
- Colete os esferoides do PSC em um tubo cônico de 15 ml delicadamente introduzindo com pipting usando o micropipetter P1000 e deixe os esferoides de estar na temperatura ambiente por 2 minutos para precipite pela gravidade. Aspirar o sobrenadante.
- Suspenda no meio do chapeamento do esferóide, dispense a suspensão em uma placa não-revestida da cultura de 6 poços em uma densidade de 4 spheroids cm-2 e cultura na incubadora do ° c 37 com 5% co2 por três dias.
3. indução hemogênica (dia 0)
- Aspirar o meio, adicionar Day0 meio de diferenciação e cultura na incubadora de 37 ° c com 5% O2 e 5% co2 (incubadora hypoxic).
- Após dois dias de cultura em meio de diferenciação Day0, aspirar o meio, em seguida, adicionar Day2 meio de diferenciação e cultura na incubadora hipóxico.
4. isolamento do endotélio Hemogênico (dia 4)
- Dois dias depois, aspirar o meio e lavar as células com PBS duas vezes. Enxague as células com solução de dissociação. Incubar na incubadora de 37 ° c com 5% CO2 por 30 min.
- Suspenda suavemente as células em 1 mM EDTA para dissociar para o nível de célula única, transferir a suspensão em um tubo cônico 50 mL e centrifugar as células em 200 x g por 3 min. aspirar o sobrenadante e suspender o pellet celular com 300 μL de separação magnética Buffer.
- Adicionar 100 μl de CD34+ microesferas e gentilmente Pipet. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Até 20 milhões células por 100 μL CD34+ Beads podem ser usados.
- Filtre a suspensão através de um filtro de células de 40 μm.
- Separe as células CD34+ usando um separador magnético.
5. indução da transição endotelial-hematopoiética (EHT)
-
Revestimento de fibronectin
- Prepare o volume necessário de 5 μg/mL de solução de revestimento fibronectina diluindo 1 mg/mL de fibronectina em PBS.
- Dispense 0,5 mL da solução de revestimento em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Incubar a chapa à temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifugue as pilhas de CD34+ classificadas em 200 x g para 3 min. Resuspend a pelota da pilha em 1 ml do meio do EHT.
- Determine a densidade de célula viável com o contador de células. Ajuste a densidade da célula para 200.000 células mL-1 adicionando o meio EHT.
- Aspirar e descartar a solução de revestimento do poço revestido com fibronectina. Dispense 0,5 mL de suspensão de células CD34+ em cada poço revestido com fibronectina.
- Incubar na incubadora hypoxic por uma semana.
6. análise de citometria de fluxo de células hematopoiéticas
- Coleção de célula flutuante: Transfira o meio de cultura para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue o meio em 200 x g por 3 min. aspirar o sobrenadante.
-
Coleção de células aderentes
- Lave as células com 0,5 mL de PBS duas vezes.
- Enxágüe as células com solução dissociadora e aspirar o líquido excedente.
- Incubar a placa na incubadora de 37 ° c por 5 min.
- Ressuscitem as células em 1 mL de tampão FACS.
- Misture as células flutuantes e as células aderentes.
- Centrifugue as células a 200 x g durante 3 min. aspirar o sobrenadante. Resuspend em 50 μL de tampão de FACS. Incubar as células com anticorpos anti-CD34 e CD45 por 1 h à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as células com PBS duas vezes e centrifugue a 200 x g durante 3 min. Aspire o sobrenadante e ressuscitem em 0,5 ml de tampão de FACS com 0,5 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole.
- Medida CD34 e expressão CD45 pelo cytometer do fluxo.
7. colônia formando unidade (CFU) ensaio de células hematopoiéticas
- Coleção de células hematopoiéticas: Transfira o meio da cultura para um tubo cônico de 15 mL. Enxaguar suavemente o poço duas vezes com PBS.
- Centrifugue as células a 200 x g durante 3 min. aspirar o sobrenadante. Ressuscitar em 1 mL de meio EHT. Determine o número da célula com o contador de células.
- Adicione um volume de suspensão equivalente a 10.000 células a 3 mL de meios à base de metilcelulose suplementados com antibióticos e misture bem 5 vezes com uma seringa de 16 G ou 18 G.
- Dispense toda a suspensão de mídia à base de metilcelulose em cada poço de uma placa de 6 poços.
- Incubar na incubadora do ° c 37 com 5% CO2 por duas semanas ao manter húmido. Não perturbe o prato. As colônias são sensíveis ao movimento.
- Depois de duas semanas, conte as colônias um microscópio.
Representative Results
Um esquema de formação de colônias PSC é representado na Figura 1a. Os esferoides do PSC são dados forma em uma embarcação plástica microfabricada por um dia. Como um resultado representativo, as pilhas 20.000 409B2 podiam ser seguradas por 96-poço da embarcação plástica micro-fabricada, embora outras linhas de pilha possam exigir uma densidade mais elevada (30000-40000 pilhas por 96-poço da embarcação plástica micro-fabricada). Essas esferas são espontaneamente achatado a uma cultura quase bidimensional quando banhado em um prato de cultura na presença de LM511-E8.
Um esquema de indução hemogênica é ilustrado na Figura 1b. Quando as colônias PSC crescem a um diâmetro de 750 μm, o meio é alterado sequencialmente para induzir organóides mesodérmicos. As colônias do PSC tornar-se-ão gradualmente um lado ensolarado acima da estrutura durante a diferenciação aos organóides mesodérmicos pela mudança média seqüencial até o dia 4. No dia 4, o endothelia hemogenic é especificado dos organóides mesodérmicos pela classificação magnética e chapeado subseqüentemente no fibronectina no meio de EHT. 5-10 milhões CD34+CD45- Cells são esperados dos esferoides que contêm 1 milhão PSCs (Figura 1C).
Observa-se que as células mudam morfologicamente de células endoteliais para hematopoiéticas (vídeo complementar 1). Uma imagem de contraste de fase representativa de células progenitoras hematopoiéticas após estimulação com coquetel hematopoiético no 7º dia é mostrada na Figura 2a. As colônias hematopoietic da pilha emergiram na cultura.
Um gráfico de citometria de fluxo representativo é mostrado na Figura 2b. A cultura inteira é estimulada com o cocktail hematopoietic e no dia 7 é analisada para a expressão de CD34 e de CD45 pelo fluxo cytometry. Células progenitoras hematopoiéticas expressam CD34 e CD45.
Um ensaio de CFU mostrou a geração de colônias dos granululocytes/macrófago das pilhas do progenitor de CD34+ CD45+ hematopoietic (Figura 2C). O número estimado de colônia é 38 CFU-G/M por 10.000 células (Figura 2D)
Figura 1: esquema das colônias do PSC da telha e da diferenciação hematopoietic subseqüente através do endothelia hemogenic. (A) processo esquemático de formação de colônias PSC. Os PSCs são mantidos em uma placa de 6 poços revestida de LM511-E8 no meio de manutenção do PSC. No dia-4, as pilhas são destacadas e dissociada ao nível da único-pilha usando a solução dissociando, revestida subseqüentemente na embarcação plástica micro-fabricada no meio da manutenção do PSC com Y-27632 e cultivado durante a noite para formar spheroids. No dia-3, os esferoides são chapeados no meio da manutenção do PSC com LM511-E8 e cultivados por três dias. Por dia 0, esferoides são espontaneamente achatado para uma cultura quase bidimensional. Barras de escala = 200 μm. (B) no dia 0, o meio é substituído por meio de diferenciação Day0 e cultivado na incubadora hipóxico. No dia 2 da diferenciação, o meio é substituído pelo meio de diferenciação Day2. No dia 4 do enriquecimento hemogénico do endotélio, as pilhas de CD34+ são classificadas magneticamente e cultivadas em uma placa de 12 poços fibronectina-revestida no meio de EHT por 6 dias. (C) parcela fluxo representativa da expressão de CD45 e de CD34 de pilhas do dia 4 ordenadas por CD34. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise da propriedade hematopoiética. (A) imagem de contraste de fase representativa de células progenitoras hematopoiéticas após estimulação com coquetel hematopoiético no 7º dia. Barra de escala = 200 μm. (B) parcela representativa de citometria de fluxo de expressão de CD45 e CD34 de cultura inteira após estimulação com coquetel hematopoiético no 7º dia. (C) imagem de contraste de fase representativa de uma colônia de granulócitos/macrófago gerada a partir de células progenitoras hematopoiéticas do dia 11. Barra de escala = 500 μm. (D) número de cfus por 10.000 células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo complementar 1: vídeo EHT. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Nosso método de indução definido sem alimentador e Xeno oferece uma plataforma precisa e econômica para induzir as células de HE de forma escalonável. A formação fiel do endotélio hemogênico nos protocolos convencionais10,11,12,13,14 foram dificultados pela falta de controle preciso da densidade e tamanho da colônia PSC, que afeta a eficiência da diferenciação dirigida à base de morfogénio/citocina. Nós tínhamos experimentado a inconsistência da indução hemogenic do endotélio em cada grupo independente dos protocolos convencionais. O protocolo novo permite a regulação apertada da densidade e do tamanho da colônia do PSC, assim supera a inconsistência da indução hemogenic do endotélio.
Nós exploramos a formação uniformizado de esferóides e, subsequentemente, transmitiu uma condição de alimentador e Xeno-livre definida para formar HE em um total de 4 dias. Nós confirmamos usando três linhas de pilha independentes que a formação do esferóide assegura a formação consistente de pilhas de He. Como resultado representativo, as linhagens de células 409B2 renderam 12,7%-23,6% de eficiência de células CD34+ com base em três experimentos independentes. O fator crítico para telha esferoides PSC é LM511-E8. Nós não recomendamos substituir este com a outra matriz, tal como Matrigel ou produtos full-length do laminina em nossas experiências. Nós experimentamos que os organóides mesodérmicos eram facilmente destacados de matrigel e perdidos durante o processo da diferenciação. E nem Matrigel ou laminina de comprimento total não ancoram células sem pré-revestimento.
A limitação potencial deste protocolo é que nós dependemos do meio de manutenção do PSC para manter PSCs. Testamos outros meios como o StemFit, mas comprometemos a indução hemogênica. Presumivelmente as pilhas eram resistentes para sair do estado pluripotente em nosso curto período de tempo (4 dias) protocolo de indução. Se um mantem PSCs em outros meios, nós recomendamos adaptar pilhas no meio da manutenção do PSC e conduzir algumas passagens antes da diferenciação. Esta plataforma permitirá a manipulação sistemática e a análise das pilhas, e a produção da fora--prateleira e a indução em grande escala de pilhas hematopoietic para o uso clínico potencial. Um objetivo a longo prazo deste sistema é modelar doenças de imunodeficiência em modelos humanizados do rato para investigar os mecanismos celulares e moleculars responsáveis e realizar Screenings da droga.
Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos a Alina li e a Seiko Benno pela sua assistência técnica. Gostaríamos também de agradecer a Sra. Harumi Watanabe por prestar assistência administrativa e Dr. Peter Karagiannis para a edição do papel. Este trabalho foi apoiado pelo núcleo central para a pesquisa de célula iPS da rede do centro de pesquisa para a realização da medicina regenerativa da Agência de Japão para a pesquisa e o desenvolvimento médicos (AMED) [M.K.S.], o programa para a pesquisa intratável das doenças Utilizando. Células iPS específicas da doença do AMED (17935423) [M.K.S.] e do programa centro de inovação da Agência de ciência e tecnologia do Japão (JST) [M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
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