Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Abstract

Die Ableitung funktioneller hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (PSCs) war ein schwer fassbares Ziel für autologe Transplantationen zur Behandlung hämatologischer und bösartiger Störungen. Hämogenes Endothel (HE) ist eine amenable-Plattform, um funktionelle HSPCs durch Transkriptionsfaktoren zu produzieren oder Lymphozyten auf robuste Weise zu induzieren. Die derzeitigen Methoden zur Ableitung von HE sind jedoch entweder kostspielig oder variabel. In diesem Protokoll haben wir eine kostengünstige und präzise Methode etabliert, um HE innerhalb von 4 Tagen in einem feeder- und xeno-freien definierten Zustand abzuleiten. Der daraus resultierende ER unterzog sich einem endotheliaal-hematopoetischen Übergang und produzierte CD34⁺CD45⁺ clonogene hämatopoetische Vorläufer. Die potenzielle Kapazität unserer Plattform zur Erzeugung funktioneller HSPCs wird breite Anwendungen bei der Krankheitsmodellierung und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Introduction

Die Entwicklung neuer Therapeutika für hämatologische und immunologische Erkrankungen wurde durch das Fehlen robuster Plattformen für die Krankheitsmodellierung und das Screening von Medikamenten mit hohem Durchsatz mit autologen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) behindert, die von Patienten abgeleitet wurden. pluripotente Stammzellen (PSCs). Der Durchbruch der induzierten (i)PSC-Technologie verspricht, Krankheiten aus Patientenzellen zu modellieren, aber die Etablierung funktioneller HSCs aus Patienten-iPSCs war schwer fassbar. Um HSCs aus menschlichen PSCs abzuleiten, ist die richtige Induktion embryonaler Muster- und Transkriptionsprogramme der Schlüssel^{1,2,3,4,5,6, 7,8}. Jüngste Fortschritte in der hämatopoetischen Entwicklung haben die Rolle des hämogen Endothel (HE) in der HSC-Entwicklung⁹gezeigt. HE kann aus PSPsinduziert werden und ist für nachgeschaltete Interventionen wie Gentransfer^10,11,12,13zugänglich. Mit HE als Plattform induzierte die Kombination von 5 Transkriptionsfaktoren (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) erfolgreich funktionelle HSCs, die langfristig engraft und in mehrere Linien differenzieren¹⁴. Die variable und ineffiziente Erzeugung von HE aus PSCs hat jedoch die systematische Manipulation und Analyse von Zellen sowie die Standardproduktion und großflächige Induktion hämatopoetischer Zellen für den klinischen Einsatz behindert.

Hier beschreiben wir eine kostengünstige und präzise Methode, um HE in 4 Tagen mit einem feeder- und xeno-freien definierten Zustand abzuleiten. Bei dieser Methode sorgt die Sphäroidbildung und spontane Reflattenierung auf iMarix-511 für eine gleichbleibende Dichte von PSC-Kolonien, was für die effiziente Induktion von HE-Zellen entscheidend ist.

Protocol

1. Reagenzien Zelllinien (menschliche PSK): erhalten entweder embryonale Stammzellen (ESCs) oder iPSC-Linien 409B2 und 201B7(317-9)) und CBA11. Reagenz-Präparation PSC-Beschichtungsmedium: PSC-Wartungsmedium mit 10 ‘M Y-27632 mischen und bei 4 °C lagern. PSC Spheroid-Fliesenmedium: Mischen Sie das PSC-Wartungsmedium mit 625–1.250 ng/ml menschlichem rekombinantem Laminin-511 E8-Fragment (LM511-E8)(je nach Zelllinie) kurz vor der Verwendung.HINWEIS: LM511-E8 kann in Medien15gemischt werden. Andere Matrix wie Volllängen-Laminin-511 muss vorbeschichtet werden, und sogar, sie tragen nicht mesodermale Organoide während des Differenzierungsprozesses haften. Tag 0 Differenzierungsmedium: Mischen Sie mesodermales Basalmedium mit 2 ‘M CHIR99021, 80 ng/mL Knochenmorphogenetischem Protein 4 (BMP4) und 80 ng/mL Vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). Tag 2 Differenzierungsmedium: Mischen Sie hämogenes Basalmedium mit 1 M SB431542, 80 ng/mL VEGF und 100 ng/mL Stammzellfaktor (SCF). Phosphatpuffer-Saline (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium vorbereiten (siehe Materialtabelle). 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer: 1 ml 0,5 M EDTA zu 500 ml PBS hinzufügen. EHT-Medium: Mischen Hematopoietic Basalmedium mit 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL Thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL Fms-bezogene Tyrosinkinase 3 Liganden (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/Interleukin-6-Rezeptor alpha (IL-6/IL-6R), Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B. FACS-Puffer: PBS mit 2% fetalem Kalbsserum und 1 mM EDTA mischen. Vorbereiten des magnetischen Trennpuffers (siehe Materialtabelle). Vorbereiten von Methylcellulose-basierten Medien (siehe Materialtabelle). 2. PSC-Koloniebildung HPSCs auf 70 – 80 % Konfluenkation auf einer 0,5 g cm-2 LM511-E8-beschichteten 6-Well-Platte in mTeSR1 in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2anbauen. PSC-Dissoziation (Tag -4) Das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung. Inkubieren Bei 37 °C für 15 min (Zellen werden in dieser Zeit nicht ausgeimpft). Die Zellen im PSC-Wartungsmedium aussetzen, die Suspension auf ein entsprechend großes Rohr übertragen und die Zellen 3 min bei 200 x g zentrifugieren. Den Überstand ansaugen und die Zellen im PSC-Beschichtungsmedium aussetzen. Die PSC-Suspension mit einer Dichte von 48.000 – 70.000 Zellen cm-2 (je nach Zelllinie) auf ein mikrogefertigtes Kunststoffgefäß aufteilenund über Nacht im 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 bebrüten.HINWEIS: Wir empfehlen 100 l well-1 der Zellsuspension in einem 96-well mikrogefertigten Kunststoffgefäß. Sie säen in der Regel 20.000 Zellen gut-1 in einer 96-Well-Platte, um etwa 100 Sphäroide zu ergeben. Fliesen PSC Sphäroide auf LM511-E8 (Tag -3) Sammeln Sie die PSC-Sphäroide in einem 15 ml konischen Rohr, indem Sie vorsichtig Pipettieren mit P1000 Mikropipetter und lassen Sie die Sphäroide bei Raumtemperatur für 2 min stehen, um durch die Schwerkraft zu fallen. Aspirieren Sie den Überstand. In Sphäroid-Beschichtungsmedium aufsetzen, die Suspension drei Tage lang in eine unbeschichtete 6-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 4-Sphäroidencm-2 und Kultur im 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 geben. 3. Hämogene Induktion (Tag 0) Aspirieren Sie das Medium, fügen Sie Day0 Differenzierungsmedium und Kultur im 37 °C Inkubator mit 5% O2 und 5% CO2 (hypoxischer Inkubator) hinzu. Nach zwei Tagen Kultur in Day0 Differenzierung medium, aspirieren Sie das Medium, dann fügen Sie Day2 Differenzierung Medium und Kultur im hypoxischen Inkubator. 4. Isolierung des hämogen Endothel (Tag 4) Zwei Tage später das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung. Inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für 30 min. Die Zellen in 1 mM EDTA vorsichtig aufhängen, um sich von der einzelzelligen Ebene zu trennen, die Suspension in ein 50 ml konisches Rohr zu übertragen und die Zellen bei 200 x g für 3 min zentrieren. stoßdämpfer. Fügen Sie 100 L CD34+ Mikroperlen und sanft Pipetten. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Es können bis zu 20 Millionen Zellen pro 100 L CD34+ Perlen verwendet werden. Filtern Sie die Suspension durch ein 40-m-Zellensieb. Trennen Sie die CD34+ Zellen mit einem magnetischen Separator. 5. Induktion des endotheliaalen zu hämatopoetischen Übergangs (EHT) Fibronectin-Beschichtung Bereiten Sie das erforderliche Volumen von 5 g/ml Fibronectin-Beschichtungslösung vor, indem Sie 1 mg/ml Fibronectin in PBS verdünnen. Geben Sie 0,5 ml der Beschichtungslösung in jeden Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min. Zentrifugieren Sie die sortierten CD34+ Zellen bei 200 x g für 3 min. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml EHT-Medium wieder auf. Bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte mit dem Zellzähler. Passen Sie die Zelldichte auf 200.000 Zellen mL-1 an, indem Sie EHT-Medium hinzufügen. Die Beschichtungslösung aus dem fibronectinbeschichteten Brunnen ansaugen und entsorgen. Geben Sie 0,5 ml CD34+ Zellsuspension in jeden fibronectinbeschichteten Brunnen. Inkubieren Sie im hypoxischen Inkubator für eine Woche. 6. Durchflusszytometrie Analyse hämatopoetischer Zellen Floating-Zell-Sammlung: Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine 15 ml kegelförmige Röhre. Zentrifugieren Sie das Medium bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Adherent-Zellsammlung Waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,5 ml PBS. Spülen Sie die Zellen mit dissoziierender Lösung und aspirieren Sie die überschüssige Flüssigkeit. Inkubieren Sie die Platte im 37 °C Inkubator für 5 min. Setzen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer wieder aus. Mischen Sie die schwebenden Zellen und anhaftenden Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend in 50 L FACS-Puffer. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD34- und Anti-CD45-Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Den Überstand ansaugen und in 0,5 ml FACS-Puffer mit 0,5 g/ml 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole wieder aufsetzen. Messen Sie die EXPRESSION CD34 und CD45 nach Durchflusszytometer. 7. Colony Forming Unit (CFU) Assay von hämatopoetischen Zellen Hämatopoetische Zellsammlung: Übertragen Sie das Medium von der Kultur auf eine 15 ml kegelförmige Röhre. Spülen Sie den Brunnen zweimal mit PBS ab. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend in 1 ml EHT Medium. Bestimmen Sie die Zellennummer mit dem Zellenzähler. Fügen Sie ein Suspensionsvolumenäquivalent von 10.000 Zellen zu 3 ml Methylcellulose-basierten Medien hinzu, die mit Antibiotika ergänzt werden, und mischen Sie sie gut 5 Mal mit einer 16 G- oder 18 G-Spritze. Geben Sie die gesamte Methylcellulose-basierte Mediensuspension in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte. Inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für zwei Wochen unter Feuchte. Stören Sie das Gericht nicht. Kolonien sind bewegungsempfindlich. Zählen Sie nach zwei Wochen die Kolonien unter dem Mikroskop.

Representative Results

Ein Schaltplan der Bildung von PSC-Kolonien ist in Abbildung 1Adargestellt. PSC-Sphäroide werden einen Tag lang auf einem mikrogefertigten Kunststoffgefäß geformt. Als repräsentatives Ergebnis könnten 20.000 409B2-Zellen pro 96-Well mikrogefertigten Kunststoffgefäßes behandelt werden, obwohl andere Zelllinien eine höhere Dichte erfordern können (30.000-40.000 Zellen pro 96-Well aus mikrogefertigtem Kunststoffgefäß). Diese Sphären werden spontan zu einer fast zweidimensionalen Kultur abgeflacht, wenn sie in Gegenwart von LM511-E8 auf ein Kulturgericht plattiert werden. Ein Schema der hämogenen Induktion ist in Abbildung 1Bdargestellt. Wenn PSC-Kolonien bis zu einem Durchmesser von 750 m wachsen, wird das Medium sequenziell geändert, um mesodermale Organoide zu induzieren. Die PSC-Kolonien werden allmählich zu einer sonnigen Seitenstruktur während der Differenzierung zu mesodermalen Organoiden durch sequenzielle mittlere Veränderung bis Tag 4. An Tag 4 werden hämogene Endothelien aus mesodermalen Organoiden durch magnetische Sortierung spezifiziert und anschließend im EHT-Medium auf Fibronectin plattiert. 5-10 Millionen CD34+CD45- Zellen werden von Sphäroiden erwartet, die 1 Million PSCs enthalten (Abbildung 1C). Es wird beobachtet, dass sich die Zellen morphologisch von endothelialer zu hämatopoetischen Zellen verändern (Ergänzendes Video 1). Ein repräsentatives Phasenkontrastbild hämatopoetischer Vorläuferzellen bei Stimulation mit hämatopoetischem Cocktail am 7. Tag ist in Abbildung 2Adargestellt. Hematopoetische Zellkolonien entstanden in der Kultur. Ein repräsentatives Strömungszytometriediagramm ist in Abbildung 2Bdargestellt. Die gesamte Kultur wird mit hämatopoetischem Cocktail stimuliert und am 7. Tag auf den Ausdruck von CD34 und CD45 durch Flow-Zytometrie analysiert. Hämatopoetische Vorläuferzellen drücken CD34 und CD45 aus. Ein CFU-Assay zeigte die Erzeugung von Granulozyten/Makrophagenkolonien aus den CD34+ CD45+ hämatopoetischen Vorläuferzellen (Abbildung 2C). Die geschätzte Koloniezahl beträgt 38 KBE-G/M pro 10.000 Zellen (Abbildung 2D) Abbildung 1: Schematische Fliesen-PSC-Kolonien und anschließende hämatopoetische Differenzierung über hämogene Endothelie. (A) Schematischer Prozess der Bildung von PSC-Kolonien. PSCs werden auf einer LM511-E8-beschichteten 6-Well-Platte in PSC-Wartungsmedium gewartet. Am Tag -4 werden die Zellen mit einer dissoziierenden Lösung auf mikrogefertigtes Kunststoffgefäß im PSC-Wartungsmedium mit Y-27632 abgetrennt und mit der einzelzelligen Ebene dissoziiert und über Nacht zu Sphäroiden kultiviert. Am Tag -3 werden Sphäroide in PSC-Wartungsmedium mit LM511-E8 plattiert und drei Tage lang kultiviert. Bis Zum 0. Tag werden Sphäroide spontan zu einer fast zweidimensionalen Kultur abgeflacht. Skalenbalken = 200 m . (B) Am Tag 0 wird das Medium durch Day0-Differenzierungsmedium ersetzt und im hypoxischen Inkubator kultiviert. Am zweiten Tag der Differenzierung wird das Medium durch das Tag2-Differenzierungsmedium ersetzt. An Tag 4 der hämogen Endothelanreicherung werden CD34+ Zellen 6 Tage lang magnetisch sortiert und auf einer fibronectinbeschichteten 12-Well-Platte im EHT-Medium kultiviert. (C) Repräsentative Flusszytometrie-Plot von CD45 und CD34 Expression von Tag 4 Zellen sortiert nach CD34. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Analyse der hämatopoetischen Eigenschaft. (A) Repräsentatives Phasenkontrastbild hämatopoetischer Vorläuferzellen nach Stimulation mit hämatopoetischem Cocktail am 7. Tag. Scale bar = 200 m. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie Plot von CD45 und CD34 Ausdruck der ganzen Kultur bei Stimulation mit hämatopoetischen Cocktail an Tag 7. (C) Repräsentatives Phasenkontrastbild einer Granulozyten-/Makrophagenkolonie, die aus tag11 hämatopoetischen Vorläuferzellen erzeugt wird. Scale bar = 500 m (D) Anzahl der KBE pro 10.000 Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzendes Video 1: EHT-Video. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Unsere feeder- und xenofreie definierte Induktionsmethode bietet eine präzise und kostengünstige Plattform, um HE-Zellen skalierbar zu induzieren. Die getreue Bildung von hämogenem Endothel in konventionellen Protokollen^{10,11,12,13,14} wurden durch das Fehlen einer präzisen Kontrolle der PSC-Koloniedichte und -größe behindert, die die Effizienz der morphogenen/zytokinbasierten gerichteten Differenzierung beeinflusst. Wir hatten in jeder unabhängigen Charge von herkömmlichen Protokollen eine Inkonsistenz der hämogenen Endothel-Induktion erfahren. Das neue Protokoll ermöglicht eine strenge Regulierung der PSC-Koloniedichte und -größe und überwindet so die Inkonsistenz der hämogenen Endothelinduktion.

Wir nutzten die uniformierte Formation von Sphäroiden und transportierten anschließend in insgesamt 4 Tagen eine feeder- und xenofreie definierte Bedingung zur Bildung von HE. Wir bestätigten anhand von drei unabhängigen Zelllinien, dass die Sphäroidbildung die konsistente Bildung von HE-Zellen sicherstellung. Als repräsentatives Ergebnis ergaben die 409B2-Zelllinien 12,7%-23,6% CD34⁺ Zelleffizienz basierend auf drei unabhängigen Experimenten. Der entscheidende Faktor für die Kachel nerieren PSC Sphäroide ist LM511-E8. Wir empfehlen nicht, dies durch andere Matrix, wie Matrigel oder vollwertige Laminin-Produkte in unseren Erfahrungen zu ersetzen. Wir haben erlebt, dass mesodermale Organoide leicht von Matrigel gelöst wurden und während des Differenzierungsprozesses verloren gingen. Und weder Matrigel noch Vollglasin verankern Zellen ohne Vorbeschichtung.

Die potenzielle Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass wir auf das PSC-Wartungsmedium angewiesen sind, um PSCs zu warten. Wir haben andere Medien wie StemFit getestet, aber wir haben die hämogene Induktion kompromittiert. Vermutlich waren Zellen in unserem kurzen (4 Tage) Induktionsprotokoll resistent gegen den Ausstieg aus dem pluripotenten Zustand. Wenn man PSCs in anderen Medien unterhält, empfehlen wir, Zellen in PSC-Wartungsmedium anzupassen und einige Passagen vor der Differenzierung durchzuführen. Diese Plattform wird die systematische Manipulation und Analyse von Zellen sowie die handelsübliche Produktion und großflächige Induktion hämatopoetischer Zellen für eine mögliche klinische Anwendung ermöglichen. Ein langfristiges Ziel dieses Systems ist es, Immunschwächeerkrankungen in humanisierten Mausmodellen zu modellieren, um die verantwortlichen zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen und Arzneimittelscreenings durchzuführen.

Materials

0.5 M EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575	0.5M EDTA
40 μm cell strainer	Corning	352340	40μM cell strainer
6 well plate	Corning	353046	6 well plate
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240-112	Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B
anti-CD34 antibody	Beckman Coulter	A07776	anti-CD34 antibody
anti-CD45 antibody	Biolegend	304012	anti-CD45 antibody
BMP4	R&D Systems	314-BP-010	BMP4
CD34 microbeads	Miltenyi	130-046-703	CD34 microbeads
CHIR99021	Wako	038-23101	CHIR99021
Essential 6	Thermo Fisher Scientific	A15165-01	Hemogenic basal medium
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A15169-01	Mesodermal basal medium
Ezsphere SP Microplate 96well	AGC	4860-900SP	micro-fabricated plastic vessel
FCS	Biosera	FB-1365/500	FCS
Fibronectin	Millipore	FC010-100MG	Fibronectin
Flt-3L	R&D Systems	308-FK-005	Flt-3L
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-Glutamine
IL-6/IL-6Rα	R&D Systems	8954-SR	IL-6/IL-6Rα
iMatrix-511	Matrixome	892 001	LM511-E8
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056	Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine
MACS buffer	Miltenyi	130-091-221	magnetic separation buffer
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched	STEMCELL TECHNOLOGIES	04435	Methylcellulose-based media
mTeSR1	STEMCELL TECHNOLOGIES	85850	PSC maintenance medium
PBS	nacalai tesque	14249-24	PBS
SB431542	Wako	031-24291	SB431542
SCF	R&D Systems	255-SC-010	SCF
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	Sigma Aldrich	S0192-500ML	Hematopoietic basal medium
TPO	R&D Systems	288-TPN	TPO
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12604-021	dissociation solution
VEGF	R&D Systems	293-VE-010	VEGF
Y-27632	Wako	253-00513	Y-27632