Summary

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

Published: June 16, 2019
doi:

Summary

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

Abstract

הנובעות גזע תפקודי המטופאות ומחולל קדמון (HSPCs) מתאי גזע האדם pluriפוטנטי (PSCs) היו מטרה חמקנית עבור השתלות אוטולוגיים לטיפול הפרעות המטולוגית וממאיר. אנדותל הומוגניים (הוא) היא פלטפורמה קלה לייצר HSPCs פונקציונלי על ידי שעתוק גורמים או כדי לגרום לימפוציטים בצורה איתנה. עם זאת, שיטות נוכחיות להפיק הוא יקר או משתנה בתשואה. בפרוטוקול זה, הקמנו שיטה חסכונית ומדויקת להפיק אותו בתוך 4 ימים במצב מזינה-ונטול xeno-מוגדר. התוצאה שהוא עבר המעבר אנדותל-אל-המטפי והופק CD34+CD45+ כclonogenic ושלתי. הקיבולת הפוטנציאלית של הפלטפורמה שלנו ליצירת HSPCs פונקציונלי יהיו יישומים נרחבים מידול מחלות והקרנה עבור תרכובות טיפוליות.

Introduction

הפיתוח של therapeutics חדש עבור הפרעות המטולוגית והחיסונית כבר הושפע מהעדר פלטפורמות חזקות עבור דוגמנות מחלות והקרנות תפוקה גבוהה ההקרנה עם תאי גזע המטולוגיים אוטולוגיים (HSCs) נגזר מהמטופל תאי גזע פלוריפוטנטי (PSCs). פריצת הדרך של המושרה (i) PSC הטכנולוגיה מחזיקה הבטחה למודל מחלות מתאי המטופלים, אבל הקמתה של HSCs פונקציונלי מiPSCs החולה היה חמקמק. על מנת להפיק HSCs מן האדם PSCs, האינדוקציה הנכונה של החשיבה העובריים ותוכניות הטרנססקריפט הוא מפתח1,2,3,4,5,6, 7,8. ההתקדמות האחרונה בהתפתחות המטתית הוכיחה את תפקידה של הומוגניים (הוא) בפיתוח HSC9. הוא יכול להיגרם מPSCs והוא נוטה להתערבות במורד הזרם כגון העברת גנים10,11,12,13. באמצעות הוא כפלטפורמה, את השילוב של 5 גורמי שעתוק (Erg, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) המושרה בהצלחה HSCs פונקציונלי כי חרט לטווח ארוך ולהבדיל לתוך מספר הגילאים14. עם זאת, הדור המשתנה והלא יעיל של הוא מ PSCs יש לבטח את מניפולציה שיטתית ניתוח של תאים יחד עם הייצור מחוץ למדף, אינדוקציה בקנה מידה גדול של תאים המטבטיים לשימוש קליני.

כאן, אנו מתארים שיטה חסכונית ומדויקת להפיק אותו ב 4 ימים עם מצב מזינה-ו-xeno-חינם מוגדר. בשיטה זו, היווצרות כספרואיד וספונטנית מחדש שיטוח ב iMarix-511 מבטיח צפיפות עקבית של מושבות PSC, אשר חיוני האינדוקציה יעיל של תאים הוא.

Protocol

1. ריאגנטים קווי תא (אדם PSCs): להשיג תאים גזע עובריים (ESCs) או הקווים iPSC 409B2 ו 201B7 (317-9)) ו CBA11. הכנה מגיב ציפוי PSC בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 10 μM Y-27632 ולאחסן ב 4 ° c. PSC ספרואיד ריצוף בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 625 – 1250 ng/mL אדם רקומביננטי למינציה-511 E8 קטע (LM511-E8) (בהתאם לקו התא) רק לפני השימוש.הערה: LM511-E8 ניתן לערבב ב-media15. מטריצה אחרת כגון באורך מלא-511 צריך להיות מצופה מראש, ואף עשה זאת, הם אינם מקיימים עיבוד מזונואידים בתהליך הבידול. יום 0 בידול בינוני: לערבב בינונית בסיס מזועורי עם 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL העצם מורמורגנטית חלבון 4 (BMP4) ו 80 Ng/ml כלי הגידול האנדותל (מנשא). יום 2 בידול בינוני: לערבב מדיום בסיס הומוגניים עם 1 μM SB431542, 80 ng/mL ו100 ng/mL תא גזע גורם (SCF). הכנת תמיסת מלח (PBS) ללא סידן או מגנזיום (ראה טבלת חומרים). 1 מ”מ (EDTA) מאגר החומצה של התרופה: להוסיף 1 מ ל של 0.5 M EDTA כדי 500 mL של PBS. Eht בינוני: לערבב המטפיאה מדיום בסיס עם 50 ng/mL scf, 20 ng/ml (tpo), 50 ng/ml fms-הקשורים טירולך קינאז 3 ליגנד (טיסה-3l), 20 ng/mL interleukin-6/אינטרלוקין-6 הקולטן אלפא (il-6/il-6rα), אינסולין-מועבר-סלניום-אתיאנאמין, L-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוריטיצין B. מאגר FACS: מערבבים PBS עם סרום עגל עוברי 2% ו 1 מ”מ EDTA. הכן מאגר הפרדה מגנטית (ראה טבלת חומרים). הכנת מתילצלולוזה מדיה מבוססת (ראה טבלת חומרים). 2. מבנה המושבה PSC לגדול hPSCs 70 – 80% שליטה על 0.5 μg ס”מ-2 LM511-E8 מצופה צלחת 6-באר ב mTeSR1 בחממה 37 ° c עם 5% CO2. PSC דיסוציאציה (יום-4) מטפי את המדיום ושוטף. את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. דגירה ב 37 ° צ’ עבור 15 דקות (התאים לא להתייבש בזמן הזה). להשעות את התאים במדיום תחזוקה PSC, להעביר את ההשעיה שפופרת בגודל מתאים וצנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. לבשל את הסופרנטאנט ולהשעות את התאים במדיום ציפוי PSC. צלחת ההשעיה PSC בצפיפות של 48,000 – 70,000 תאים cm-2 (בהתאם לקו התא) אל כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ו דגירה לילה בחממה 37 ° c עם 5% CO2.הערה: אנו ממליצים 100 μL היטב1 של השעיית תא בכלי פלסטיק 96-היטב מיקרו מפוברק. אתה בדרך כלל זרע 20,000 תאים היטב-1 בצלחת 96-באר כדי להניב כ 100 spheroids. ריצוף PSC הרואידים ב LM511-E8 (יום-3) לאסוף את PSC spheroids ב 15 מ”ל שפופרת חרוט על ידי ליטוף בעדינות באמצעות P1000 microפיפיטר ולהשאיר את spheroids לעמוד בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות כדי לזרז על ידי כוח הכבידה. . ומכה את הסופרנטאנט השהה במדיום ציפוי ספרואיד, לוותר על ההשעיה לתוך הלוח מצופה 6-היטב התרבות בצפיפות של 4-spheroids ס”מ-2 ותרבות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שלושה ימים. 3. מעבר הומוגניים (יום 0) מDay0 את המדיום, להוסיף בינוני ותרבות ב37 ° c בחממה עם 5% O2 ו 5% CO2 (חממה ארוי). לאחר יומיים של תרבות ב Day0 בידול בינוני, מרוב המדיום, לאחר מכן להוסיף Day2 בידול בינוני ותרבות בחממה ארוי. 4. בידוד הומוגניים אנדותל (יום 4) יומיים לאחר מכן, מטפי את המדיום. ושוטף את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור 30 דקות. בעדינות להשעות את התאים ב 1 מ”מ EDTA כדי לנתק את הרמה תא בודד, להעביר את ההשעיה לתוך שפופרת 50 mL ו צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. ומתה את supernatant ולהשעות את הגלולה תא עם 300 μl של הפרדה מגנטית אגר. הוסף 100 μL של CD34+ מיקרוחרוזי ובעדינות pipet. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להשתמש עד 20,000,000 תאים לכל 100 μL CD34+ חרוזים. לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 40 יקרומטר. הפרד את התאים CD34+ באמצעות מפריד מגנטי. 5. אינדוקציה של מעבר אנדותל (EHT) ציפוי פיברוטין הכן את הנפח הנדרש של 5 μg/mL fibronectin פתרון ציפוי על ידי דילול 1 מ”ג/mL fibronectin ב PBS. מדבקות 0.5 mL של פתרון הציפוי לתוך כל טוב של לוחית של 24 היטב תרבות. מודקת את הצלחת בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. צנטריפוגה את CD34+ תאים ממוינים ב 200 x g עבור 3 דקות. השהה מחדש את התא גלולה ב 1 מ ל של מדיום eht. קבע את צפיפות התא הקיימא עם מונה התא. כוונן את צפיפות התא ל-200,000 תאים mL-1 על-ידי הוספת מדיום eht. מפחית ומפחית את הפתרון ציפוי מתוך הבאר מצופה fibronectin. מדבקות 0.5 mL של CD34+ תא הבולם לתוך כל fibronectin מצופה היטב. מודטה בחממה הארוי. לשבוע אחד 6. הזרמת כדוריות התאים אוסף תאים צף: העבר את מדיום התרבות לצינורית חרוטית בגודל 15 מ”ל. צנטריפוגה את המדיום ב 200 x g עבור 3 דקות.. ומכה את הסופרנטאנט אוסף תאים מחסיד שטוף את התאים עם 0.5 מ ל של PBS פעמיים. לשטוף את התאים עם פתרון הנתק ומכה את הנוזל העודף. מודקת את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 5 דקות. השהה מחדש את התאים ב-1 mL של מאגר FACS. לערבב את התאים צף תאים חסיד. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב-50 μL של מאגר FACS. דגירה את התאים עם אנטי CD34 ואנטי CD45 נוגדנים עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות. מרוב הסופרנטאנט ולהשעות מחדש ב 0.5 mL של מאגר facs עם 0.5 μg/mL 4 ‘, 6-diamidino-2-פניינילידול. מדידת CD34 ו-CD45 ביטוי על ידי cytometer זרימה. 7. המושבה היחידה (CFU) שיטת היווצרות תאים מהמטפאות מתחת לאוסף התאי המטכיפת: העבירו את המדיום מהתרבות לצינור החרוט בגודל 15 מ”ל. שטוף בעדינות את הבאר פעמיים עם PBS. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב 1 מ ל של מדיום EHT. קבע מספר תא עם מונה התא. הוסף נפח השעיה המקבילה של 10,000 תאים 3 מ ל של מתילתאית מדיה מבוססת בתוספת אנטיביוטיקה ומערבבים היטב 5 פעמים עם 16 G או 18 גרם מזרק. לוותר על כל מתילתאית מבוססי התקשורת מושעה לתוך כל טוב של צלחת 6-היטב. מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שבועיים תוך שמירה על לח. . אל תפריע לצלחת . המושבות רגישות לתנועה אחרי שבועיים, תספור את. המושבות מתחת למיקרוסקופ

Representative Results

סכמטית של יצירת מושבות PSC מתוארת באיור 1A. PSC spheroids נוצרות על כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ליום אחד. כתוצאה מייצגת, 20,000 409B2 תאים יכול להיות מטופל לכל 96-גם של כלי פלסטיק מיקרו מפוברק, למרות קווי תאים אחרים עשויים לדרוש צפיפות גבוהה יותר (30000-40000 תאים לכל 96-טוב של כלי פלסטיק מיקרו מפוברק). התחומים הללו משוטחים באופן ספונטני לתרבות כמעט דו-ממדית כאשר הם מצופים בתבשיל תרבות בנוכחות LM511-E8. תרשים של אינדוקציה הומוגניים מומחש באיור 1B. כאשר PSC מושבות לגדול בקוטר של 750 μm, המדיום שונה ברציפות כדי לגרום לאורגנואידים מזועורי. מושבות PSC יהיה בהדרגה להיות בצד שטוף שמש למעלה מבנה במהלך הבידול כדי מזונואידים הגוף על ידי שינוי בינוני רציפה עד יום 4. ביום 4, הומוגניים אנדותאליה מצוינים באמצעות מיון מגנטי ומצופה לאחר מכן על fibronectin במדיום EHT. 5-10 מיליון CD34+CD45- תאים צפויים מפני spheroids המכיל 1,000,000 PSCs (איור 1c). הוא ציין כי התאים מורפולוגית לשנות מאנדותל לתאים המטבטיים (וידאו משלים 1). דמות ייצוגית בעלת ניגודיות מלאה של התאים המטבטיים על גירוי בקוקטייל המטפאות ביום 7 מוצג באיור 2A. מושבות התא המטפאות. הופיעו בתרבות זרם מייצג cy, התוויה העלילה מוצג באיור 2B. התרבות כולה מגורה עם קוקטייל המטופאות וביום 7 מנותח עבור הביטוי של CD34 ו-CD45 על ידי הזרמת cy try. . CD34 וCD45 שיטת CFU הראה את הדור של גרנולוציטים/מקרופאג מושבות מתוך CD34+ CD45+ המטפאות בתאי קדמון (איור 2c). מספר המושבה המשוערת הוא 38 CFU-G/M לתאים 10,000 (איור 2D) איור 1: סכמטית של ריצוף מושבות PSC ובידול המטפאות הבאים באמצעות הומוגניים אנדותאליה. (א) תהליך סכמטי של יצירת מושבות PSC. PSCs מתוחזקים על צלחת מצופה מLM511 בגודל 6-E8 במדיום תחזוקה PSC. ביום-4, תאים מנותקים מתנתק לרמה בודדת תא באמצעות פתרון הניתוק, מצופה לאחר מכן על כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ב PSC בינוני תחזוקה עם Y-27632 ומתורבת לילה כדי spheroids טופס. ביום -3, spheroids מצופים במדיום תחזוקה PSC עם LM511-E8 ומתורבת למשך שלושה ימים. לפי יום 0, הספרואידים משוטחים באופן ספונטני לתרבות כמעט דו-ממדית. קנה מידה ברים = 200 μm. (ב) ביום 0, המדיום מוחלף Day0 בידול בינוני ותרבותי בחממה ארוי. ביום השני של הבידול, המדיום מוחלף בDay2 בידול. ביום 4 של העשרה הומוגניים אנדותל, CD34+ תאים הם מיון מגנטית ומתורבת על fibronectin מצופה בצלחת 12-באר ב eht בינונית במשך 6 ימים. (ג) הנציג flowcyCD45 try העלילה של ביטוי CD34 של יום 4 תאים מיון על ידי CD34. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: ניתוח של רכוש המטפי. (א) דמות ייצוגית מייצגת בתאי מחולל מצוי לאחר גירוי בקוקטייל המטופאות ביום 7. סרגל בקנה מידה = 200 μm. (ב) זרם מייצג cy, לנסות העלילה של CD45 ו CD34 ביטוי של תרבות שלמה על גירוי עם קוקטייל המטופאות ביום 7. (ג) דמות מייצגת של מושבה של גרנולוציט/מקרופאג שנוצרו מיום 11 בתאי מחולל המטפאות. סרגל קנה מידה = 500 μm. (D) מספר התאים של cfus לכל 10,000. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. וידאו משלימים 1: וידאו EHT. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

שיטת האינדוקציה שלנו מזינה-ו-xeno-חינם מציעה פלטפורמה מדויקת וחסכונית כדי לגרום לתאים באופן מדרגי. היווצרות נאמן של הומוגניים אנדותל בפרוטוקולים קונבנציונליים10,11,12,13,14 כבר הושפע על ידי חוסר שליטה מדויקת של PSC מושבת צפיפות וגודל, אשר משפיע על היעילות של המורפולדור/cytokine מבוססי בידול מונחה. . בכל אצווה עצמאית מפרוטוקולים קונבנציונליים הפרוטוקול החדש מאפשר רגולציה הדוקה של צפיפות וגודל המושבה של PSC, וכך מתגבר על חוסר העקביות של האינדוקציה האנדוגנית.

אנחנו לנצל את היווצרות במדים של spheroids ולאחר מכן הועברו מזינה-ו-xeno מוגדר תנאי הגדרה לטופס הוא בסך הכל 4 ימים. שהמערך הספרואיד מבטיח. את היווצרות התאים העקביים כתוצאה מייצגת, קווי התא 409B2 הניבו 20.5%-23.6% CD34+ תא יעילות על בסיס שלושה ניסויים עצמאיים. הגורם הקריטי לאריח PSC spheroids הוא LM511-E8. אנחנו לא ממליצים להחליף את זה עם מטריקס אחרים, כגון מטריצות או באורך מלא של מוצרים בחוויות שלנו. הצלחנו להתנתק בקלות ממטג. ולאיבוד בתהליך הבידול וגם לא מטריצות או באורך מלא למינציה לא עוגן תאים ללא ציפוי מראש.

המגבלה הפוטנציאלית של פרוטוקול זה היא שאנחנו תלויים במדיום תחזוקה PSC כדי לשמור על PSCs. , בדקנו מדיה אחרת כגון סטפי. אבל סיכנת השראה כנראה תאים היו עמידים ליציאה ממצב pluripotent בזמן הקצר שלנו (4 ימים) הפרוטוקול האינדוקציה. אם אדם שומר PSCs במדיה אחרת, אנו ממליצים על התאמת תאים במדיום תחזוקה PSC ולנהל כמה מעברים לפני בידול. פלטפורמה זו תאפשר מניפולציה שיטתית וניתוח של תאים, ואת ייצור מחוץ למדף, אינדוקציה בקנה מידה גדול של תאים המטפאות לשימוש קליני פוטנציאלי. מטרה ארוכת טווח של מערכת זו היא לדגמן מחלות כשל חיסוני בדגמי עכבר הומניזציה כדי לחקור את המנגנון הסלולר והמולקולרי האחראי ולבצע הקרנות סמים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה לאלינה לי ו Seiko Benno על הסיוע הטכני שלהם. אנחנו גם רוצים להודות לגברת הרמי וואטאנאבה על מתן סיוע מינהלי וד ר פיטר קארגיאניס על עריכת העיתון. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מרכז ליבה של iPS מחקר התא של רשת מרכז המחקר למימוש של רפואה רגנרטיבית מהסוכנות יפן למחקר ופיתוח רפואי (M.K.S.), התוכנית לחקר מחלות סורר ניצול. מחלות ספציפיות כדוריות ה-iPS של M.K.S. (17935423) [] ו המרכז לחדשנות תוכנית של יפן מדע וטכנולוגיה הסוכנות (JST) [R.O. ו M.K.S.].

Materials

0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575 0.5M EDTA
40 μm cell strainer Corning 352340 40μM cell strainer
6 well plate Corning 353046 6 well plate
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-112 Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B
anti-CD34 antibody Beckman Coulter A07776 anti-CD34 antibody
anti-CD45 antibody Biolegend 304012 anti-CD45 antibody
BMP4 R&D Systems 314-BP-010 BMP4
CD34 microbeads Miltenyi 130-046-703 CD34 microbeads
CHIR99021 Wako 038-23101 CHIR99021
Essential 6 Thermo Fisher Scientific A15165-01 Hemogenic basal medium
Essential 8 Thermo Fisher Scientific A15169-01 Mesodermal basal medium
Ezsphere SP Microplate 96well AGC 4860-900SP micro-fabricated plastic vessel 
FCS Biosera FB-1365/500 FCS
Fibronectin Millipore FC010-100MG Fibronectin
Flt-3L R&D Systems 308-FK-005 Flt-3L
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine
IL-6/IL-6Rα R&D Systems 8954-SR IL-6/IL-6Rα
iMatrix-511 Matrixome 892 001 LM511-E8
ITS-X Thermo Fisher Scientific 51500-056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine
MACS buffer Miltenyi 130-091-221 magnetic separation buffer
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched STEMCELL TECHNOLOGIES 04435 Methylcellulose-based media
mTeSR1 STEMCELL TECHNOLOGIES 85850 PSC maintenance medium
PBS nacalai tesque 14249-24 PBS
SB431542 Wako 031-24291 SB431542
SCF R&D Systems 255-SC-010 SCF
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium Sigma Aldrich S0192-500ML Hematopoietic basal medium
TPO R&D Systems 288-TPN TPO
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12604-021 dissociation solution
VEGF R&D Systems 293-VE-010 VEGF
Y-27632 Wako 253-00513 Y-27632

References

  1. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  2. Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
  3. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  4. Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
  5. Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
  6. Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
  7. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  8. Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don’t forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
  9. Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
  10. Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261 (2011).
  11. Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
  12. Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
  13. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
  14. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  15. Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165 (2017).

Play Video

Cite This Article
Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition. J. Vis. Exp. (148), e59823, doi:10.3791/59823 (2019).

View Video