여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.
인간 다능성 줄기 세포 (PSCs)에서 기능성 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)를 유도하는 것은 혈액학 및 악성 장애를 치료하는 자가 이식에 대한 어려운 목표였습니다. 혈우병 내피 (HE)는 전사 인자에 의해 기능성 HSPC를 생산하거나 강력한 방식으로 림프구를 유도하는 의무 플랫폼입니다. 그러나 HE를 파생하는 현재의 방법은 수율에 비용이 많이 들거나 가변적입니다. 이 프로토콜에서는 피더 및 제노가 없는 정의된 조건에서 4일 이내에 HE를 도출하는 비용 효율적이고 정밀한 방법을 확립했습니다. 그 결과 HE는 내피-투-조혈 전이를 겪고 CD34+CD45+ 클로노제닉 조혈 전구를 생산했다. 기능성 HSPC를 생성하기 위한 당사의 플랫폼의 잠재적 용량은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 분야가 있을 것입니다.
혈액학 및 면역 학적 장애에 대한 새로운 치료법의 개발은 환자에서 파생 된 자가 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 통한 질병 모델링 및 높은 처리량 약물 스크리닝을위한 강력한 플랫폼의 부족으로 인해 방해받고 있습니다. 다능성 줄기 세포 (PSC). 유도된 (i)PSC 기술의 돌파구는 환자의 세포에서 질병을 모델링하는 약속을 보유합니다, 그러나 참을성 있는 iPSCs에서 기능성 HSC의 설치는 애매했습니다. 인간 PSC에서 HSC를 파생시키기 위하여는, 배아 패터닝 및 전사프로그램의 적당한 유도는 열쇠 1, 2,3,4, 5,6, 7,8. 최근 조혈발달의 진전은 HSC 개발9에서 혈생내피(HE)의 역할을 입증하고있다. HE는 PSC로부터 유도될 수 있고 유전자 전달10,11, 12,13과같은 하류 개입에 순응한다. HE를 플랫폼으로 사용하여, 5가지 전사 인자(ERG,HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1)의조합을 통해 장기간 이식하고 다중 계보14로 분화하는 기능성 HSC를 성공적으로 유도하였다. 그러나, PSCs에서 HE의 가변적이고 비효율적인 생성은 임상 사용을 위한 조혈 세포의 기성 생산 및 대규모 유도와 더불어 세포의 체계적인 조작 그리고 분석을 방해했습니다.
여기서, 우리는 피더- 및 제노 가없는 정의 된 조건으로 4 일 안에 HE를 도출하는 비용 효과적이고 정확한 방법을 설명합니다. 이 방법에서는 iMarix-511에서 스페로이드 형성 및 자발적인 재평화는 HE 세포의 효율적인 유도에 중요한 PSC 콜로니의 일관된 밀도를 보장합니다.
당사의 피더 및 제노 프리 정의 유도 방법은 HE 세포를 확장 가능한 방식으로 유도하는 정확하고 비용 효율적인 플랫폼을 제공합니다. 종래의 프로토콜10,11,12,13,14에서 혈혈성 내피의 충실한 형성은 PSC 콜로니 밀도 및 크기의 정밀한 제어의 부족에 의해 방해되고 있다, 모르포겐/사이토카인 기반 의 방향 분화의 효율성에 영향을 미칩니다. 우리는 기존의 프로토콜에서 각 독립적 인 배치에서 혈생 내피 유도의 불일치를 경험했다. 새로운 프로토콜은 PSC 콜로니 밀도 및 크기의 엄격한 조절을 가능하게하여 혈우병 내피 유도의 불일치를 극복합니다.
우리는 스페로이드의 균일 한 형성을 악용하고 이어서 총 4 일 만에 HE를 형성하기 위해 피더 및 제노가없는 정의 된 조건을 전달했습니다. 우리는 스페로이드 형성이 HE 세포의 일관된 형성을 보장한다는 것을 3개의 독립적인 세포주를 사용하여 확인했습니다. 대표적인 결과로서, 409B2 세포주들은 3개의 독립적인 실험에 기초하여 12.7%-23.6% CD34+ 세포 효율을 산출하였다. PSC 스페로이드 타일에 중요한 요소는 LM511-E8입니다. 우리는 우리의 경험에 있는 Matrigel 또는 전신 라미닌 제품과 같은 그밖 매트릭스로 이것을 대체하는 것을 추천하지 않습니다. 우리는 중피소노노이드가 마트리겔에서 쉽게 분리되어 분화 과정에서 손실되는 것을 경험했습니다. 그리고 마트리겔 이나 전체 길이 라미닌 은 사전 코팅없이 세포를 고정하지 않습니다.
이 프로토콜의 잠재적제한은 PSC 유지 관리 매체에 의존하여 PSC를 유지 관리한다는 것입니다. 우리는 StemFit와 같은 다른 매체를 시험했습니다, 그러나 우리는 혈생 유도를 손상했습니다. 아마도 세포는 우리의 짧은 시간 (4 일) 유도 프로토콜에서 다능성 상태에서 출구에 저항했다. 다른 매체에서 PSC를 유지하는 경우, PSC 유지 보수 배지에 세포를 적응시키고 분화하기 전에 몇 개의 구절을 수행하는 것이 좋습니다. 이 플랫폼은 세포의 체계적인 조작 및 분석, 그리고 잠재적 인 임상 사용을위한 조혈 세포의 기성 생산 및 대규모 유도를 허용합니다. 이 시스템의 장기적인 목표는 책임있는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하고 약물 스크리닝을 수행하기 위해 인간화 된 마우스 모델에서 면역 결핍 질환을 모델링하는 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그들의 기술 지원에 대한 Alina 리와 세이코 벤노에 감사드립니다. 또한 행정 지원을 제공한 와타나베 하루미 씨와 피터 카라기아니스 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 일본 의학 연구 개발기관 (AMED)에서 재생 의학의 실현을위한 연구 센터 네트워크의 iPS 세포 연구 의 핵심 센터에 의해 지원되었다 (M.K.S.], 난치성 질환 연구를위한 프로그램 활용. AMED(17935423) [M.K.S.] 및 일본 과학기술청(JST) 혁신 센터[R.O. 및 M.K.S.]의 질병 별 iPS 세포.
0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5M EDTA |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B |
anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |