Her præsenterer vi en protokol til præcist at danne hemogen endotelet fra humane pluripotente stamceller i en feeder-og Xeno-fri tilstand. Denne metode vil have brede anvendelsesmuligheder i sygdom modellering og screening for terapeutiske forbindelser.
Afledte funktionelle hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller (Hspc’er) fra humane pluripotente stamcelle (kvikskrankerne) har været et flygtigt mål for autologe transplantationer til behandling af hæmatologiske og maligne lidelser. Hemogenic endothel (HE) er en genstand platform til at producere funktionelle hspc’er ved transkription faktorer eller til at inducere lymfocytter på en robust måde. Men de nuværende metoder til at udlede HE er enten dyrt eller variable i udbyttet. I denne protokol etablerede vi en omkostningseffektiv og præcis metode til at udlede HE inden for 4 dage i en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand. Den resulterende han gennemgik en Endothelial-til-hæmatopoietisk overgang og producerede CD34+CD45+ clonogenic hæmatopoietiske progenitorer. Den potentielle kapacitet af vores platform til at generere funktionelle Hspc’er vil have brede applikationer i sygdoms modellering og screening for terapeutiske forbindelser.
Udviklingen af nye lægemidler til hæmatologiske og immunologiske lidelser er blevet hæmmet af manglen på robuste platforme til sygdoms modellering og høj gennemstrømning af lægemiddel screening med autologe hæmatopoietiske stamceller (HSCs) afledt af patientens pluripotente stamceller (kvikskranker). Gennembruddet i den inducerede (i) PSC-teknologi lover at modellere sygdomme fra patienternes celler, men etableringen af funktionelle Hsc’er fra patient-iPSCs har været undvigende. For at kunne udlede hscs fra menneskelige kvikskranker er den korrekte induktion af embryonale mønster-og transskriptionelle programmer nøgle1,2,3,4,5,6, 7,8. Nylige fremskridt inden for hæmatopoietisk udvikling har vist den rolle, som hemogen endotelet (HE) i HSC udvikling9. Han kan induceres fra kvikskrankerne og er i stand til at gribe ind i nedstrømsinterventioner såsom genoverførsel10,11,12,13. Ved hjælp af HE som en platform, kombinationen af 5 transkription faktorer (ERG, HOXA5, HOXA9, lcor, RUNX1) med succes inducerede funktionelle hscs at indpode langsigtede og differentiere i flere slægter14. Variabel og ineffektiv generering af HE fra kvikskrankerne har imidlertid hæmmet den systematiske manipulation og analyse af celler sammen med den off-the-shelf produktion og store induktion af hæmatopoietiske celler til klinisk brug.
Her beskriver vi en omkostningseffektiv og præcis metode til at udlede HE i 4 dage med en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand. I denne metode sikrer sfæroide dannelse og spontan re-samkopiering på imarix-511 en konsistent tæthed af PSC-kolonier, hvilket er afgørende for effektiv induktion af HE-celler.
Vores feeder-og Xeno-fri definerede induktions metode tilbyder en præcis og omkostningseffektiv platform til at inducere HE-celler på en skalerbar måde. Den trofaste dannelse af hemogen endotelet i konventionelle protokoller10,11,12,13,14 er blevet hæmmet af manglen på præcis kontrol af PSC koloni tæthed og størrelse, som påvirker effektiviteten af morphogen/cytokin baseret målrettet differentiering. Vi havde oplevet inkonsistens af hemogen endotelet induktion i hver uafhængig batch fra konventionelle protokoller. Den nye protokol giver mulighed for stram regulering af PSC koloni tæthed og størrelse, dermed overvinder den inkonsekvente af hemogenic endotelinduum induktion.
Vi udnyttede den uniformerede dannelse af sfæroider og overbragte efterfølgende en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand til at danne HE i alt 4 dage. Vi bekræftede ved hjælp af tre uafhængige cellelinjer, at sfæoide dannelsen forsikrer den konsekvente dannelse af HE celler. Som et repræsentativt resultat gav 409B2-celle linjerne 12,7%-23,6% CD34+ celle effektivitet baseret på tre uafhængige eksperimenter. Den kritiske faktor for Tile-sfæroider er LM511-E8. Vi anbefaler ikke at erstatte dette med andre matrix, såsom Matrigel eller fuld længde Laminin produkter i vores erfaringer. Vi oplevede, at mesodermal organoider let blev løsrevet fra Matrigel og tabte under differentierings processen. Og hverken Matrigel eller fuld-længde Laminin ikke forankre celler uden præ-belægning.
Den mulige begrænsning af denne protokol er, at vi er afhængige af PSC-vedligeholdelses mediet for at vedligeholde kvikskrankerne. Vi har testet andre medier som StemFit, men vi kompromitteret hemogenic induktion. Formentlig celler var resistente over for at forlade pluripotente tilstand i vores korte tid (4 dage) induktion protokol. Hvis man vedligeholder kvikskrankerne i andre medier, anbefaler vi at tilpasse cellerne i PSC-vedligeholdelses mediet og gennemføre et par passager før differentiering. Denne platform vil tillade systematisk manipulation og analyse af celler, og off-the-shelf produktion og storstilet induktion af hæmatopoietiske celler til potentiel klinisk brug. Et langsigtet mål med dette system er at modellere immundefekt sygdomme i humaniserede musemodeller for at undersøge de ansvarlige cellulære og molekylære mekanismer og gennemføre lægemiddel screeninger.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Alina Li og Seiko Benno for deres tekniske assistance. Vi vil også gerne takke fru Harumi Watanabe for at yde administrativ bistand og Dr. Peter Karagiannis til at redigere papiret. Dette arbejde blev støttet af Core Center for iPS Cell Research af Research Center netværk for realisering af regenerativ medicin fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling (AMED) [M.K.S.], programmet for Intractable sygdomme Research Udnytte. Sygdomsspecifikke iPS-celler af AMED (17935423) [M.K.S.] og Center for innovation-programmet for Japans videnskabs-og teknologi agentur (JST) [R.O. og M.K.S.].
0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5M EDTA |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B |
anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |