تشكيل الخلايا الخلايا المعتمية الإنسان على أفلام الشيتوسان
Summary
هنا، نقدم بروتوكولات زراعة رباط اللثة البشري (PDL) كرويرويدالخلية من قبل أفلام شيتوسان. توفر ثقافة الكرويات الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) بديلاً عن نظام ثقافة البوليسترين التقليدي للأنسجة (TCPS).
Abstract
الرباط اللثة (PDL) الخلايا تحمل وعدا كبيرا لتجديد الأنسجة اللثة. تقليديا، يتم زرع خلايا PDL على ركائز ثنائية الأبعاد (2D) مثل الأنسجة المستزرعة البوليستيرين (TCPS). ومع ذلك، لوحظت تغييرات مميزة من خلايا PDL أثناء الثقافة في المختبر. هذه الظاهرة ربما لأن TCPS 2D يختلف عن البيئة الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. بالمقارنة مع الخلايا المستزرعة على ركائز 2D، والخلايا المزروعة في بيئة صغيرة 3D تظهر المزيد من أوجه التشابه مع الخلايا الحية. ولذلك، توفر نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد بديلاً واعداً لثقافة الخلايا الأحادية الطبقة ذات الـ 2D التقليدية. لتحسين نماذج ثقافة الخلايا PDL التقليدية، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد، والتي تقوم على تشكيل كروي لخلايا PDL على أفلام الشيتوسان. هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة ثقافة كروية الخلية على أساس أفلام شيتوسان. نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد من الكرويات الخلوية PDL التغلب على بعض القيود المتعلقة التقليدية 2D وحيد الطبقة خلية الثقافة، وبالتالي قد تكون مناسبة لإنتاج خلايا PDL مع فعالية علاجية معززة لتجديد الأنسجة اللثة في المستقبل.
Introduction
يتميز داء اللثة، الذي تهيئته بشكلرئيسي لوحة الأسنان 1، بتلف الأنسجة اللثة بما في ذلك الرباط اللثةي (PDL)، وعظم السنخية، والأسمنت. العلاجات الحالية لداء اللثة عادة ما تكون ناجحة في منع تقدم المرض النشط، ولكن تجديد الأنسجة اللثة المفقودة لا يزال تحديا سريريا. في الآونة الأخيرة، تم إحراز تقدم هام في النهج القائمة على الخلايا لتجديد الأنسجة اللثة للتغلب على عيوب العلاجات الحالية2،3،4.
كشفت مراجعتنا المنهجية السابقة أن خلايا PDL أظهرت إمكانات كبيرة لتجديد اللثة5. تقليديا، يتم زرع خلايا PDL على ركائز ثنائية الأبعاد (2D) مثل الأنسجة المستزرعة البوليستيرين (TCPS). ومع ذلك، لوحظت تغييرات مميزة من خلايا PDL خلال الثقافة في المختبر6. هذه الظاهرة ربما لأن TCPS 2D يختلف عن في الحي 3-الأبعاد (3D) microenvironment7. بالمقارنة مع الخلايا المستزرعة على ركائز 2D، والخلايا التي تزرع في بيئة صغيرة 3D تظهر المزيد من أوجه التشابه إلى الخلايا في الجسم الحي8. ولذلك، توفر نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد بديلاً واعداً لثقافة الخلايا الأحادية الطبقة ذات الـ 2D التقليدية.
أسلوب الثقافة التقليدية 3D هو تغليف الخلايا في المواد الحيوية 3D. مقارنة مع الخلايا مغلفة في المواد الحيوية 3D، وكروية الخلوية تحاكي الوضع في الجسم الحي بشكل أوثق لأن الكرويدات هي مجاميع من الخلايا التي تنمو خالية من المواد الأجنبية9،10،11، 12. وتفيد التقارير أن الكرويات الخلوية تشجع الأنشطة البيولوجية MSC عن طريق الحفاظ على مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) بما في ذلك الفيبرونيكتين والصفيحين13. لتحسين نماذج ثقافة الخلية PDL التقليدية، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة ثقافة الخلية 3D PDL، والذي يقوم على تشكيل كروي من خلايا PDL على أفلام شيتوسان14. زيادة تشكيل كروي ة تجديد الذات والقدرات التمايز ية العظام من الخلايا PDL14. هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة PDL الخلية كروية ثقافة استنادا إلى أفلام شيتوسان. نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد من الكرويات الخلوية PDL التغلب على بعض أوجه القصور المتعلقة التقليدية ثقافة خلايا TCPS، وبالتالي قد تكون مناسبة لإنتاج خلايا PDL مع فعالية علاجية معززة لتجديد الأنسجة اللثة في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أدخلت هذه الدراسة نظام ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتغلب على بعض القيود المتعلقة بثقافة الخلايا الأحادية الطبقة ذات الطبقة 2D التقليدية. وفقا للبروتوكول، تم تشكيل spheroids PDL الخلوية بنجاح من قبل الخلايا زراعة على أفلام الشيتوسان. وأفادت دراستنا السابقة أن تشكيل كروي زاد من قدرات التجد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد رعت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 81700978)، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (1504219050)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (17ZR1432800)، ومشروع شنغهاي للاستكشاف الطبي ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
