Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films
Summary
Hier presenteren we protocollen van kweken menselijke parodontitis ligament (PDL) cel sferoïden door Chitosan films. De cultuur van drie-dimensionale (3D) cellulaire sferoïden biedt een alternatief voor conventionele weefselcultuur polystyreen (TCPS) cultuursysteem.
Abstract
Parodontitis ligament (PDL) cellen houden grote belofte voor parodontitis weefselregeneratie. Conventioneel worden PDL-cellen gekweekt op twee-dimensionale (2D) substraten zoals weefselcultuur polystyreen (TCPS). Nochtans, zijn de kenmerkende veranderingen van PDL cellen waargenomen tijdens in vitro cultuur. Dit fenomeen is waarschijnlijk omdat de 2D TCPS verschilt van de in vivo driedimensionale (3D) microomgeving. In vergelijking met cellen die op 2D-substraten worden gekweekt, vertonen cellen in een 3D-omgeving meer gelijkenissen met in vivo cellen. Daarom, 3D-cel cultuur modellen bieden een veelbelovend alternatief voor conventionele 2D monolayer Cell cultuur. Ter verbetering van conventionele PDL Cell cultuur modellen, hebben we onlangs ontwikkelde een 3D-cel cultuurmethode, die is gebaseerd op sferoïde vorming van PDL cellen op Chitosan films. Hier presenteren we gedetailleerde Cell sferoïde cultuur protocollen op basis van Chitosan films. De 3D-cultuursysteem van PDL cellulaire sferoïden overwinnen enkele van de beperkingen met betrekking tot conventionele 2D monolayer cel cultuur, en kan dus geschikt zijn voor het produceren van PDL cellen met een verbeterde therapeutische werkzaamheid voor de toekomst parodontitis weefselregeneratie.
Introduction
Parodontitis, voornamelijk geïnitialiseerd door tandplaque1, wordt gekenmerkt door de schade van parodontitis met inbegrip van PARODONTITIS (PDL), alveolaire bot, en cementum. Huidige behandelingen voor parodontitis zijn meestal succesvol in het voorkomen van de voortgang van de actieve ziekte, maar de regeneratie van verloren parodontitis weefsels blijft een klinische uitdaging. Onlangs is belangrijke vooruitgang geboekt in de cel-gebaseerde benaderingen voor parodontitis weefselregeneratie om de nadelen van de huidige behandelingen te overwinnen2,3,4.
Onze vorige systematische herziening bleek dat PDL cellen groot potentieel voor parodontitis regeneratie5toonde. Conventioneel worden PDL-cellen gekweekt op twee-dimensionale (2D) substraten zoals weefselcultuur polystyreen (TCPS). Nochtans, zijn de kenmerkende veranderingen van PDL cellen waargenomen tijdens in vitro cultuur6. Dit fenomeen is waarschijnlijk omdat de 2D TCPS verschilt van de in vivo driedimensionale (3D) microenvironment7. In vergelijking met cellen gekweekt op 2D substraten, cellen geteeld in een 3D-omgeving vertonen meer gelijkenissen met in vivo cellen8. Daarom, 3D-cel cultuur modellen bieden een veelbelovend alternatief voor conventionele 2D monolayer Cell cultuur.
Conventionele 3D-cultuurmethode is inkapselen van cellen in 3D biomaterialen. Vergeleken met cellen ingekapseld in 3D biomaterialen, cellulaire sferoïden na te bootsen de in vivo situatie nauwer omdat sferoïden zijn aggregaten van cellen groeien vrij van buitenlandse materialen9,10,11, 12. men rapporteert dat cellulaire sferoïden MSC bioactiviteiten bevorderde via het behoud van extracellulaire matrijs (ECM) componenten met inbegrip van fibronectine en laminin13. Ter verbetering van conventionele PDL Cell cultuur modellen, hebben we onlangs ontwikkelde een 3D-PDL Cell cultuurmethode, die is gebaseerd op sferoïde vorming van PDL cellen op Chitosan films14. De vorming van sferoïde verhoogde de zelf-vernieuwing en osteogene differentiatie capaciteiten van PDL cellen14. Hier presenteren we gedetailleerde PDL Cell sferoïde cultuur protocollen op basis van Chitosan films. De 3D-cultuursysteem van PDL cellulaire sferoïden overwinnen enkele van de tekortkomingen in verband met conventionele TCPS cel cultuur, en kan dus geschikt zijn voor het produceren van PDL cellen met een verbeterde therapeutische werkzaamheid voor de toekomst parodontitis weefselregeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige studie introduceerde een 3D-cel cultuursysteem om enkele beperkingen met betrekking tot conventionele 2D monolayer cel cultuur te overwinnen. Volgens het Protocol, werden PDL cellulaire sferoïden met succes gevormd door kweken cellen op Chitosan films. Onze vorige studie meldde dat sferoïde vorming verhoogde de zelf-vernieuwing en osteogene differentiatie capaciteiten van PDL cellen14. In plaats van het gebruiken van een enzym om cellen van TCPS te oogsten, zou de cel sferoïden van P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesponsord door National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), fundamenteel Onderzoekfondsen voor de centrale universiteiten (1504219050), Natural Science Foundation van Shanghai (17ZR1432800), en Shanghai Medical Exploration project ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
