키토산 필름에 인간 치주 인대 세포 스페로이드의 형성
Summary
여기에서, 우리는 키토산 필름에 의하여 인간 치주 인대 (PDL) 세포 스페로이드를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 3차원(3D) 세포 스페로이드의 배양은 기존의 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 배양 시스템에 대한 대안을 제공한다.
Abstract
치주 인대 (PDL) 세포는 치주 조직 재생에 대한 큰 약속을 보유하고. 종래, PDL 세포는 조직 배양 폴리스티렌(TCPS)과 같은 2차원(2D) 기판에 배양된다. 그러나, PDL 세포의 특징적인 변화는 시험관 내 배양 동안 관찰되었다. 이러한 현상은 아마도 2D TCPS가 생체 내 3차원(3D) 미세 환경과 다르기 때문일 것이다. 2D 기질에서 배양된 세포에 비해, 3D 미세환경에서 자란 세포는 생체내 세포와 더 유사성을 나타낸다. 따라서, 3D 세포 배양 모델은 기존의 2D 단층 세포 배양에 대한 유망한 대안을 제공한다. 기존의 PDL 세포 배양 모델을 개선하기 위해, 우리는 최근에 키토산 필름에 PDL 세포의 스페로이드 형성을 기반으로 하는 3D 세포 배양 방법을 개발했습니다. 여기에서, 우리는 키토산 필름에 근거를 둔 상세한 세포 스페로이드 배양 프로토콜을 제시합니다. PDL 세포 스페로이드의 3D 배양 시스템은 기존의 2D 단층 세포 배양과 관련된 몇 가지 한계를 극복하고, 따라서 향후 치주 조직 재생을 위한 향상된 치료 효능을 가진 PDL 세포를 생산하는데 적합할 수 있다.
Introduction
치주염은 주로 치석 1에의해 초기화되며 치주 인대 (PDL), 폐포 뼈 및 시멘트를 포함한 치주 조직의 손상을 특징으로합니다. 치주염에 대한 현재의 치료법은 일반적으로 활성 질환의 진행을 예방하는 데 성공적이지만 손실 된 치주 조직의 재생은 임상 적 과제로 남아 있습니다. 최근, 현재 치료2,3,4의 단점을 극복하기 위해 치주조직 재생을 위한 세포기반 접근법에서 중요한 진전이 이루어지고 있다.
우리의 이전 체계적인 검토는 PDL 세포가 치주재생을 위한 중대한 잠재력을 보였다는 것을 밝혔습니다 5. 종래, PDL 세포는 조직 배양 폴리스티렌(TCPS)과 같은 2차원(2D) 기판에 배양된다. 그러나, PDL 세포의 특징적인 변화는 시험관내 배양 동안 관찰되었다 6. 이러한 현상은 아마도 2D TCPS가 생체 내 3차원(3D) 미세환경7과다르기 때문일 것이다. 2D 기질에서 배양된 세포에 비해, 3D 미세환경에서 성장한 세포는생체내 세포8과 더 유사성을 나타낸다. 따라서, 3D 세포 배양 모델은 기존의 2D 단층 세포 배양에 대한 유망한 대안을 제공한다.
기존의 3D 배양 방법은 3D 생체 재료로 세포를 캡슐화하는 것입니다. 3D 생체 재료에 캡슐화 된 세포와 비교하여, 세포 스페로이드는 이물질이 없는 세포의 응집체이기 때문에 생체 내상황을 더 밀접하게 모방9,10,11, 12. 세포 스페로이드는 섬유넥틴 및 라미닌(13)을 포함하는 세포외 매트릭스(ECM) 성분의보존을 통해 MSC 생체활동을 촉진한 것으로 보고된다. 종래의 PDL 세포 배양 모델을 개선하기 위해, 우리는 최근에 키토산필름(14)에PDL 세포의 스페로이드 형성을 기반으로 하는 3D PDL 세포 배양 방법을 개발하였다. 스페로이드 형성은 PDL세포(14)의자가 재생 및 골성 분화 용량을 증가시킵니다. 여기서, 키토산 필름에 기초한 상세한 PDL 세포 스페로이드 배양 프로토콜을 제시한다. PDL 세포 스페로이드의 3D 배양 시스템은 기존의 TCPS 세포 배양과 관련된 몇 가지 단점을 극복하고, 따라서 향후 치주 조직 재생을 위한 향상된 치료 효능을 가진 PDL 세포를 생산하는데 적합할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 기존의 2D 단층 세포 배양과 관련된 몇 가지 한계를 극복하기 위해 3D 세포 배양 시스템을 도입하였다. 프로토콜에 따르면, PDL 세포 스페로이드는 키토산 필름상에 세포를 배양함으로써 성공적으로 형성되었다. 우리의 이전 연구는 스페로이드 형성이 PDL 세포의 자기 갱신 및 골성 분화 능력을 증가시키는 것을 보고했다14. TCPS에서 세포를 수확하는 효소를 사용하는 대신…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC 81700978), 중앙 대학 (1504219050), 상하이 자연 과학 재단 (17ZR1432800), 상하이 의료 탐사 프로젝트 ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
