Dannelse av Human periodontal leddbånd Cell Spheroids på Chitosan Films
Summary
Her presenterer vi protokoller av dyrking menneskelige periodontal leddbånd (PDL) celle spheroids av Chitosan filmer. Kulturen i tre-dimensjonale (3D) Cellular spheroids gir et alternativ til konvensjonell vev kultur polystyren (TCPS) kultur system.
Abstract
Periodontal leddbånd (PDL) cellene holder store løftet for periodontal vev gjenfødelse. Konvensjonelt, er PDL celler kultivert på to-dimensjonale (2D) underlag som vev kultur polystyren (TCPS). Imidlertid har karakteristiske endringer av PDL celler blitt observert under in vitro kultur. Dette fenomenet er sannsynligvis fordi 2D TCPS skiller seg fra in vivo tredimensjonale (3D) mikromiljøet. Sammenlignet med celler kultivert på 2D-underlag, har celler dyrket i en 3D-mikromiljøet, mer likheter med in vivo-celler. Derfor, 3D cellekultur modeller gir et lovende alternativ for konvensjonelle 2D monolag cellekultur. For å forbedre konvensjonelle PDL cellekultur modeller, har vi nylig utviklet en 3D-cellekultur metode, som er basert på spheroid dannelse av PDL celler på Chitosan filmer. Her presenterer vi detaljert celle spheroid kultur protokoller basert på Chitosan filmer. Den 3D-kultur system av PDL mobilnettet spheroids overvinne noen av begrensningene knyttet til konvensjonelle 2D monolag cellekultur, og dermed kan være egnet for å produsere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidig periodontal vev gjenfødelse.
Introduction
Periodontitt, initialisert hovedsakelig av Dental plakk1, er preget av skaden av periodontal vev inkludert periodontal LEDDBÅND (PDL), alveolære bein, og cementen. Nåværende behandlinger for periodontitt er vanligvis vellykket i å forebygge fremdriften av den aktive sykdommen, men regenerering av tapt periodontal vev forblir en klinisk utfordring. Nylig har viktig fremgang er gjort i celle-baserte tilnærminger for periodontal vev gjenfødelse å overvinne ulempene med dagens behandlinger2,3,4.
Vår tidligere systematisk gjennomgang avslørte at PDL celler viste stort potensial for periodontal regenerering5. Konvensjonelt, er PDL celler kultivert på to-dimensjonale (2D) underlag som vev kultur polystyren (TCPS). Imidlertid har karakteristiske endringer av PDL celler blitt observert under in vitro kultur6. Dette fenomenet er sannsynligvis fordi 2D TCPS skiller seg fra in vivo tredimensjonale (3D) mikromiljøet7. Sammenlignet med celler som er kultivert på 2D-underlag, har celler som dyrkes i 3D-mikromiljøet, mer likheter med in vivo-celler8. Derfor, 3D cellekultur modeller gir et lovende alternativ for konvensjonelle 2D monolag cellekultur.
Konvensjonell 3D-kultur metoden er innkapsle celler i 3D-Biomaterials. Sammenlignet med celler innkapslet i 3D Biomaterials, cellular spheroids etterligne in vivo situasjonen tettere fordi spheroids er aggregater av celler vokser fritt for utenlandske materialer9,10,11, 12. det er rapportert at mobilnettet SPHEROIDS forfremmet MSC bioactivities via bevaring av ekstracellulære MATRISE (ECM) komponenter inkludert fibronektin og laminin13. For å forbedre konvensjonelle PDL cellekultur modeller, har vi nylig utviklet en 3D PDL cellekultur metode, som er basert på spheroid dannelse av PDL celler på Chitosan filmer14. Spheroid formasjon økte selv Fornyelses-og osteogen differensiering kapasiteter av PDL celler14. Her presenterer vi detaljert PDL celle spheroid kultur protokoller basert på Chitosan filmer. Den 3D-kultur system av PDL mobilnettet spheroids overvinne noen av svakhetene knyttet til konvensjonelle TCPS cellekultur, og dermed kan være egnet for å produsere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidig periodontal vev gjenfødelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende studien introduserte en 3D cellekultur system for å overvinne noen begrensninger knyttet til konvensjonelle 2D monolag cellekultur. Ifølge protokollen ble PDL Cellular spheroids vellykket dannet av dyrking celler på Chitosan filmer. Vår tidligere studie rapporterte at spheroid formasjon økte selv-fornyelse og osteogen differensiering kapasitet på PDL celler14. I stedet for å bruke et enzym for å høste celler fra TCPS, kan PDL celle spheroids høstes fra Chitosan filmer ved…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble sponset av National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 81700978), grunnleggende forskningsmidler for de sentrale universitetene (1504219050), Natural Science Foundation i Shanghai (17ZR1432800), og Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).
Materials
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
