A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene
Summary
Un test précis et robuste basé sur la réaction en chaîne de polymérase pour quantifier les répétitions de trinucleotide cytosine-guanine-guanine dans le gène fragile x de retardmental-1 facilite le diagnostic moléculaire et le criblage du syndrome de LX fragile et du X fragile-connexe avec un délai d’attente plus court et des investissements dans l’équipement.
Abstract
Le syndrome de X fragile (FXS) et les désordres associés sont provoqués par l’expansion du cytosine-guanine-guanine (CGG) répétition de trinucleotide dans la région non traduite de 5′ (UTR) du retardement mental fragile x-1 (FMR1) promoteur de gène. Traditionnellement, l’analyse de fragment d’électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique est utilisée pour le dimensionnement des répétitions CGG de FMR1, mais une analyse supplémentaire de tache méridionale est nécessaire pour la mesure exacte lorsque le nombre de répétition est supérieur à 200. Ici, nous présentons une méthode précise et robuste de réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour quantifier les répétitions de CGG de FMR1. La première étape de ce test est l’amplification PCR des séquences répétitifs dans le 5’UTR du promoteur FMR1 à l’aide d’un kit Fragile X PCR, suivie de la purification des produits PCR et du dimensionnement par fragment sur un instrument d’électrophorèse capillaire microfluidique, et l’interprétation ultérieure du nombre de répétitions cGG en faisant référence à des normes avec des répétitions connues à l’aide du logiciel d’analyse. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d’identifier toute la gamme des répétitions CGG des promoteurs FMR1, y compris ceux avec un nombre répété de plus de 200 (classés comme mutation complète), 55 à 200 (prémutation), 46 à 54 (intermédiaire), et 10 à 45 (normal). Il s’agit d’une méthode rentable qui facilite la classification des troubles associés au FXS et à l’X fragile avec robustesse et temps de déclaration rapide.
Introduction
Le syndrome de L’X fragile (FXS) et les troubles associés à l’X fragile, par exemple, le syndrome des tremblements et de l’ataxie (FX-TAS) et l’insuffisance ovarienne primaire (FX-POI) sont principalement causés par l’expansion du trinuccléotide cytosine-guanine-guanine (CGG) dans le 5′ non traduit région (UTR) du fragile X mental retardation-1 (FMR1) gène sur Xq27.31,2. La protéine codée FMR1 (FMRP) est une protéine liant l’ARN associée au polyribosome qui fonctionne dans le développement neuronal et la plasticité synaptique en régulant l’épissage alternatif, la stabilité, et le transport dendritique de l’ARNm ou la synthèse modulatrice des protéines postsynaptiques partielles3,4,5,6,7.
La variation dynamique avec une taille de répétition CGG de ‘gt;200 est décrite comme mutation complète, qui induit l’hyperméthylation aberrante et le silençage transcriptionnel suivant du promoteur FMR1 8. L’absence ou l’absence résultante de la protéine FMRP perturbe le développement neuronal normal et cause FXS9, caractérisé par divers symptômes cliniques, y compris une déficience intellectuelle modérée à sévère, retard de développement, comportements hyperactifs, contacts pauvres et manifestations autistiques10,11,12. La présentation dans les patients féminins de FXS est généralement plus douce que cela chez les mâles. La taille de répétition de CGG s’étendant de 55 à 200 et 45 à 54 sont classifiées comme prémutation et statut intermédiaire, respectivement. En raison du degré élevé d’instabilité, la taille de répétition de CGG dans un allèle de prémutation ou intermédiaire se développe vraisemblablement une fois transmise des parents à la progéniture13,14. Ainsi, les porteurs avec des allèles de prémutation sont à haut risque d’avoir des enfants affectés avec FXS en raison de l’expansion répétée, et dans certains cas, les allèles intermédiaires peuvent augmenter leur taille de répétition à la gamme complète de mutation sur deux générations15, 16. En outre, les mâles avec la prémutation transmettent également le risque accru de développer le FX-TAS de tard-de-démarrage17,18,19, tandis que les femelles de prémutation sont prédisposées pour FX-TAS et FX-POI20, 21,22. Récemment, il a été rapporté que les désordres de spectre autistique avec le retard développemental et les problèmes dans les comportements sociaux sont présentés chez les enfants avec des alleles fMR1 de prémutation23,24.
Pour déterminer la taille exacte de répétition de CGG est d’une grande importance pour la classification et la prévision des désordres FXS et X-associés fragiles25,26. Historiquement, la réaction en chaîne de polymérase (PCR) spécifique à la région de CGG avec le dimensionnement de fragment plus l’analyse méridionale de tache ont été l’étalon-or pour le profilage moléculaire de la répétition de FMR1 CGG27. Cependant, pcR spécifique traditionnel est moins sensible aux grandes prémutations avec plus de 100 à 130 répétitions et est incapable d’amplifier les mutations complètes27,28. En outre, l’électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique traditionnel pour le dimensionnement répété ne détecte pas les produits FMR1 PCR avec plus de 200 répétitions CGG. L’analyse de tache méridionale permet la différenciation d’une plus large gamme de taille de répétition, des nombres normaux aux nombres complets de répétition de mutation, et a été employée couramment pour confirmer des mutations complètes (chez les mâles) et différencier des allèles hétérozygotes avec une mutation complète de apparemment homozygous alleles avec des tailles normales de répétition (chez les femelles). Cependant, la résolution pour quantifier les répétitions est limitée. Plus important encore, cette stratégie de test étape par étape est laborieuse, longue et inefficace sur le plan des coûts.
Ici, nous présentons une méthode précise et robuste basée sur PCR pour quantifier les répétitions CGG de FMR1. La première étape de ce test est l’amplification PCR des séquences répétées dans le 5’UTR du promoteur FMR1 à l’aide du kit Fragile X PCR. Les produits PCR sont purifiés et le dimensionnement des fragments est effectué sur un instrument d’électrophorèse capillaire microfluidique, et l’interprétation ultérieure du nombre de répétitions CGG à l’aide du logiciel d’analyse en faisant référence à des normes avec des répétitions connues basées sur le justification que la longueur du fragment de PCR est directement proportionnelle au nombre de répétitions CGG. Le système PCR comprend des réactifs qui facilitent l’amplification de la région de répétition du trinucleotide très riche en GC. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d’identifier toutes les gammes de répétitions CGG des promoteurs FMR1. Il s’agit d’une méthode rentable qui peut trouver une large application dans le diagnostic moléculaire et le dépistage des maladies et des troubles liés à l’X fragile avec moins de temps de contournement et d’investissement dans l’équipement et, par conséquent, peut être utilisé dans un plus large éventail de cliniques Laboratoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
FXS est la deuxième cause la plus fréquente de déficience intellectuelle après la trisomie 21, représentant près de la moitié du retard mental lié à l’X30, qui peut affecter environ 1 homme sur 4 000 et 1 femme sur 8 000. Plus important encore, près d’une femme sur 250 à 1 000 porte une prémutation, et cette fréquence est de 1 sur 250 à 1 600 chez les hommes26,31,32,<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée par des subventions du NSFC Emergency Management Project (Grant no 81741004), de la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), du Plan de recherche majeur de la Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Subvention No. AB16380219), la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) et la Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
| FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
| FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
| NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Paper towels | |||
| PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
| reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
| S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
| TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |
References
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