Un ensayo robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X mental retardado-1
Summary
Un ensayo preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X de retraso mental-1 facilita el diagnóstico molecular y el cribado del síndrome de X frágil y las repeticiones X frágiles trastornos con menor tiempo de respuesta e inversión en equipos.
Abstract
El síndrome X frágil (FXS) y los trastornos asociados son causados por la expansión de la repetición de trinucleótido de citosina-guanina-guanina (CGG) en la región no traducida (UTR) de 5′ del promotor del gen Frágil X de retardación mental-1 (FMR1). Convencionalmente, el análisis de fragmentos de electroforesis capilar en un analizador genético se utiliza para el dimensionamiento de las repeticiones CGG de FMR1,pero se requiere un análisis adicional de la mancha sureña para la medición exacta cuando el número de repetición es superior a 200. Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación por PCR de las secuencias de repetición en el 5’UTR del promotor FMR1 utilizando un kit de PCR X Frágil, seguido de la purificación de los productos pcR y el tamaño de los fragmentos en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y interpretación posterior del número de repeticiones de CGG haciendo referencia a normas con repeticiones conocidas utilizando el software de análisis. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar toda la gama de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1, incluidos aquellos con un número repetido de más de 200 (clasificados como mutación completa), 55 a 200 (premutación), 46 a 54 (intermedio) y 10 a 45 (normal). Es un método rentable que facilita la clasificación de los trastornos asociados al FXS y X frágiles con robustez y tiempo de notificación rápido.
Introduction
Los trastornos asociados al síndrome De X frágil (FXS) y X frágil, por ejemplo, el síndrome de temblor y ataxia (FX-TAS), y la insuficiencia ovárica primaria (FX-POI) son causados principalmente por la expansión de repetición de trinucleótidos de citosina-guanina-guanina (CGG) en los 5′ no traducidos (UTR) del gen de retardo mental X frágil-1 (FMR1) en Xq27.31,2. La proteína codificada FMR1 (FMRP) es una proteína de unión al ARN asociada al polisistores que funciona en el desarrollo neuronal y la plasticidad sináptica regulando el empalme alternativo, la estabilidad y el transporte dendrítico de ARNm o síntesis moduladora de proteínas postsinápticas parciales3,4,5,6,7.
La variación dinámica con un tamaño de repetición CGG de >200 se describe como mutación completa, que induce la hipermetilación aberrante y el posterior silenciamiento transcripcional del promotor FMR1 8. La ausencia o falta resultante de la proteína FMRP interrumpe el desarrollo neuronal normal y causa FXS9,caracterizado por varios síntomas clínicos, incluyendo discapacidad intelectual moderada a grave, retraso del desarrollo, comportamientos hiperactivos, contactos pobres y manifestaciones autistas10,11,12. La presentación en pacientes con FXS femeninos es generalmente más leve que la de los hombres. El tamaño de repetición de CGG que oscila entre 55 y 200 y 45 a 54 se clasifican como premutación y estado intermedio, respectivamente. Debido al alto grado de inestabilidad, el tamaño de repetición CGG en una premutación o alelo intermedio presumiblemente se expande cuando se transmite de los padres a la descendencia13,14. Por lo tanto, los portadores con alelos de premutación tienen un alto riesgo de tener niños afectados con FXS debido a la expansión repetida, y en algunos casos, los alelos intermedios pueden ampliar su tamaño de repetición a todo el rango de mutación durante dos generaciones15, 16. Además, los machos con premutación también transmiten un mayor riesgo de desarrollar FX-TAS17,18,19,mientras que las hembras de premutación están predispuestas tanto para FX-TAS como para FX-POI20, 21,22. Recientemente, se ha informado de que los trastornos del espectro autista con retraso del desarrollo y los problemas en las conductas sociales se presentan en niños con premutación FMR1 alelos23,24.
Para determinar el tamaño exacto de la repetición CGG es de gran importancia para la clasificación y predicción de los trastornos asociados al FXS y Xfrágiles 25,26. Históricamente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica de la región de cGG con tamaño de fragmento más análisis de manchas del sur han sido el estándar de oro para el perfilmolecular de la repetición FMR1 CGG27. Sin embargo, la PCR específica tradicional es menos sensible a las premutaciones grandes con más de 100 a 130 repeticiones y es incapaz de amplificar mutaciones completas27,28. Además, la electroforesis capilar en un analizador genético tradicional para el tamaño repetido no detecta los productos de PCR FMR1 con más de 200 repeticiones De CGG. El análisis de la mancha meridional permite la diferenciación de una gama más amplia de tamaño de repetición, de números de repetición de mutaciones normales a completos, y se ha utilizado ampliamente para confirmar mutaciones completas (en varones) y diferenciar alos heterocigotos con una mutación completa de aparentemente alelos homocigotos con tamaños de repetición normales (en hembras). Sin embargo, la resolución para cuantificar las repeticiones es limitada. Más importante aún, esta estrategia de pruebas paso a paso requiere mucha mano de obra, requiere mucho tiempo y es ineficaz en cuanto a costos.
Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en PCR para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación PCR de las secuencias de repetición en el 5’UTR del promotor FMR1 utilizando el kit de PCR Frágil X. Los productos PCR son purificados y el tamaño de fragmentos se realiza en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y la interpretación posterior del número de repeticiones de CGG utilizando el software de análisis haciendo referencia a estándares con repeticiones conocidas basadas en el la longitud de los fragmentos de PCR es directamente proporcional al número de repeticiones de CGG. El sistema PCR incluye reactivos que facilitan la amplificación de la región de repetición de trinucleótidos altamente rica en GC. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar todas las gamas de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1. Este es un método rentable que puede encontrar una amplia aplicación en el diagnóstico molecular y el cribado de trastornos relacionados con FXS y X frágiles con menos tiempo de respuesta e inversión en equipos y, por lo tanto, puede ser utilizado en un espectro más amplio de clínica Laboratorios.
Protocol
Representative Results
Discussion
FXS es la segunda causa más común de deterioro intelectual después de la trisomía 21, que representa casi la mitad del retraso mental ligado al X30, que puede afectar aproximadamente a 1 de cada 4.000 hombres y 1 de cada 8.000 mujeres. Más importante aún, casi 1 de cada 250–1.000 hembras lleva una premutación, y esta frecuencia es 1 en 250-1.600 en los machos26,31,32,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Proyecto de Manejo de Emergencias de la NSFC (Grant No. 81741004), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi ( Concesión No. AB16380219), la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Concesión No. 2018M630993) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (Concesión No. 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
| FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
| FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
| NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Paper towels | |||
| PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
| reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
| S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
| TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |
References
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
- Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
- Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
- Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
- Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
- Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
- Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
- Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
- Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
- Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
- Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
- Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
- Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
- Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
- Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
- Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
- Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
- Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d’endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
- Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
- Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
- Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
- Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
- Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
- Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
- Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
- Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
- Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
- Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene–and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
- Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
- Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
- Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
- Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
- Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
- Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
- Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
- Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).
