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Genetics

Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

Ein genauer und robuster, auf Polymerasekettenreaktion basierender Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen im Fragile X-Gen für geistige Retardierung-1 erleichtert die molekulare Diagnose und das Screening des Fragile X-Syndroms und des fragilen X-bezogenen Störungen mit kürzerer Umschaltzeit und Investitionen in Ausrüstung.

Abstract

Fragiles X-Syndrom (FXS) und damit verbundene Störungen werden durch die Ausdehnung des Cytosin-Guanin-Guanin-Guin-Tricleid-Repeats (CGG) in der5' unübersetzten Region (UTR) des fragilen X-Genpromotors verursacht. Konventionell wird die Kapillarelektrophoresefragmentanalyse auf einem genetischen Analysator für die Dimensionierung der CGG-Wiederholungen von FMR1verwendet, aber für die genaue Messung, wenn die Wiederholungszahl höher als 200 ist, ist eine zusätzliche Südfleckanalyse erforderlich. Hier stellen wir eine genaue und robuste Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen in der 5'UTR des FMR1-Promotors mit einem Fragile X PCR-Kit, gefolgt von der Reinigung der PCR-Produkte und der Fragmentierung auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument, und anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen durch Verweise auf Standards mit bekannten Wiederholungen mithilfe der Analysesoftware. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, die gesamte Bandbreite der CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotoren zu identifizieren, einschließlich derjenigen mit einer Wiederholungszahl von mehr als 200 (klassifiziert als vollständige Mutation), 55 bis 200 (Vormutation), 46 bis 54 (Zwischen- und 10 bis 45 (normal). Es ist eine kostengünstige Methode, die die Klassifizierung der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen mit Robustheit und schneller Berichtszeit erleichtert.

Introduction

Fragiles X-Syndrom (FXS) und fragile X-assoziierte Erkrankungen, z. B. Tremor- und Ataxie-Syndrom (FX-TAS), und primäre Ovarialinsuffizienz (FX-POI) werden hauptsächlich durch Cytosin-Guanin-Guanin (CGG) Trinukleotid-Wiederholungsexpansion in der 5' unübersetzten (UTR) des fragilen X-Gens für geistige Retardierung-1 (FMR1) auf Xq27.31,2. Das FMR1-kodierte Protein (FMRP) ist ein polyribosom-assoziiertes RNA-bindendes Protein, das in der neuronalen Entwicklung und synaptischen Plastizität funktioniert, indem es alternative Spleiß-, Stabilitäts- und dendritische Transporte von mRNA oder modulierender Synthese reguliert. von partiellen postsynaptischen Proteinen3,4,5,6,7.

Die dynamische Variation mit einer CGG-Wiederholungsgröße von >200 wird als vollständige Mutation beschrieben, die die aberrante Hypermethylierung und die anschließende Transkriptionssilencing des FMR1-Promotors 8induziert. Das daraus resultierende Fehlen oder Fehlen des FMRP-Proteins stört die normale neuronale Entwicklung und verursacht FXS9, gekennzeichnet durch verschiedene klinische Symptome, einschließlich mittelschwerer bis schwerer geistiger Behinderung, Entwicklungsverzögerung, hyperaktives Verhalten, schlechte Kontakte und autistische Manifestationen10,11,12. Die Darstellung bei weiblichen FXS-Patienten ist in der Regel milder als bei Männern. Die CGG-Wiederholungsgröße von 55 bis 200 bzw. 45 bis 54 wird als Vormutation bzw. Zwischenstatus klassifiziert. Aufgrund des hohen Grades an Instabilität dehnt sich die CGG-Wiederholungsgröße in einem Vormutations- oder Zwischenallel vermutlich aus, wenn sie von den Eltern auf den Nachwuchs übertragen wird13,14. So sind Träger mit Prämutationsallelen aufgrund der wiederholten Expansion einem hohen Risiko ausgesetzt, Kinder mit FXS zu haben, und in einigen Fällen können Zwischenallele ihre Wiederholungsgröße über zwei Generationen auf den vollen Mutationsbereich ausdehnen15, 16. Darüber hinaus vermitteln Männchen mit Vormutation auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von FX-TAS17,18,19, während Prämutationsweibchen sowohl für FX-TAS als auch FX-POI20prädisponiertsind, 21,22. Kürzlich wurde berichtet, dass autistische Spektrumstörungen mit Entwicklungsverzögerung und Probleme im Sozialen Verhalten bei Kindern mit Vormutation FMR1-Alleles 23,24dargestellt werden.

Um die genaue CGG-Wiederholungsgröße zu bestimmen, ist von großer Bedeutung für die Klassifizierung und Vorhersage der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen25,26. Historisch gesehen war die CGG-Repeat-regionsspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Fragmentgrößen- und Südfleckanalyse der Goldstandard für die molekulare Profilierung der FMR1 CGG-Wiederholung27. Herkömmliche spezifische PCR ist jedoch weniger empfindlich gegenüber großen Vormutationen mit mehr als 100 bis 130 Wiederholungen und ist nicht in der Lage, vollständige Mutationen zu verstärken27,28. Darüber hinaus kann die Kapillarelektrophorese auf einem herkömmlichen genetischen Analysator für die Wiederholte Dimensionierung FMR1-PCR-Produkte mit mehr als 200 CGG-Wiederholungen nicht erkennen. Die Southern Blot-Analyse ermöglicht die Differenzierung eines größeren Spektrums von Wiederholungsgrößen, von normalen bis zu vollständigen Mutations-Wiederholungszahlen, und wurde häufig zur Bestätigung vollständiger Mutationen (bei Männern) und zur Differenzierung heterozygoter Allele mit einer vollständigen Mutation von scheinbar homozygote Allele mit normalen Wiederholungsgrößen (bei Weibchen). Die Auflösung für die Quantifizierung der Wiederholungen ist jedoch begrenzt. Noch wichtiger ist, dass diese Schritt-für-Schritt-Teststrategie arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kostenlos ist.

Hier stellen wir eine genaue und robuste PCR-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen im 5'UTR des FMR1-Promotors mit fragilem X PCR-Kit. Die PCR-Produkte werden gereinigt und die Fragmentgröße wird auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument durchgeführt, und die anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen mit hilfe der Analysesoftware erfolgt, indem Aufschluss über Standards mit bekannten Wiederholungen auf der Grundlage der Begründung, dass die PCR-Fragmentlänge direkt proportional zur Anzahl der CGG-Wiederholungen ist. Das PCR-System enthält Reagenzien, die die Amplifikation des hochGC-reichen Trinukleotid-Repeat-Bereichs erleichtern. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, alle Bereiche von CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotern zu identifizieren. Dies ist eine kostengünstige Methode, die eine breite Anwendung in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Störungen mit weniger Umlaufzeit und Investitionen in Ausrüstung finden kann und somit in einem breiteren Spektrum von klinischen Labors.

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Protocol

Die ethische Zulassung wurde von der Joint Chinese University of Hong Kong–New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee erteilt (Referenznummer: 2013.055)

1. PCR-Verstärkung

  1. Entfernen Sie vor dem Start PCR-Puffermischung, Probenverdünnungs- und DNA-Proben (sowohl Test- als auch Referenz-DNA) (siehe Materialtabelle)aus dem Gefrierschrank von -20 °C und halten Sie sie 20–30 min bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien und DNA vollständig aufgetaut sind. Wirbel und kurz nach unten drehen vor der Verwendung.
  2. Messen Sie die Konzentration der DNA-Proben mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle). Die DNA-Konzentration sollte 25 ng/l betragen; falls erforderlich, mit Probenverdünnung auf die entsprechende Konzentration verdünnen.
    HINWEIS: Die DNA sollte extrahiert und gereinigt werden, um störende Substanzen wie Proteine und hohe Salzkonzentrationen zu entfernen. Nicht degradierte, hochwertige DNA sollte für die nachfolgende PCR-Verstärkung und Analyse verwendet werden (A260/A280: 1.8–2.0 und A260/A230: >1.0).
  3. Beschriften Sie Brunnen einer PCR-Platte oder 0,2 ml PCR-Röhren, um Referenz- und getestete DNA-Proben zu identifizieren.
  4. Berechnen Sie die Anzahl der PCR-Reaktionen, die für die Testproben, 2 Referenzproben und negative Kontrollproben erforderlich sind. Bereiten Sie den PCR-Master-Mix vor, indem Sie 15 L PCR-Puffermischung, 2,6 l Probenverdünnungsmittel und 0,4 l Polymerase für jede Reaktion hinzufügen.
    HINWEIS: Eine negative Kontrolle mit Probenverdünnungsmittel ist wichtig, um die PCR-Leistung zu überwachen. Bereiten Sie die PCR-Master-Mischung bei Raumtemperatur, nicht Pipette auf Eis. Der PCR-Puffermix ist viskos. Mischen Sie das Rohr und drehen Sie dann kurz nach unten vor der Verwendung.
  5. Vortex den PCR-Master-Mix von Schritt 1.4 für 10-20 s und Spin-down. Geben Sie langsam 18 l der Mischung in jeden Brunnen oder jedes Rohr.
  6. Wirbel und Spinnen Sie die DNA-Proben. Pipette 2 l jeder DNA in den entsprechenden Brunnen oder Rohr für ein endgültiges PCR-Volumen von 20 l. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 5 mal.
    HINWEIS: Die Gesamtmenge der DNA pro Reaktion sollte 50–100 ng betragen. DNA-Mengen größer als 150 ng pro 20 L PCR-Reaktion können zu einer schlechten Amplifikation großer Wiederholungsallele führen. Bei niedriger konzentrierten DNAs kann die Menge des Probenverdünnungsmittels im PCR-Mastermix durch eine DNA-Lösung ersetzt werden.
  7. Versiegeln Sie die Platte mit Klebeplattenversiegelung oder mit Rohrkappen.
  8. Legen Sie die versiegelte PCR-Platte oder Die Rohre in den Thermocycler mit beheiztem Deckel. Führen Sie das Programm mit den folgenden Einstellungen aus: 95 °C für 5 min, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 35 s, Glühen bei 59 °C für 35 s und Verlängerung bei 72 °C für 4 min; einen letzten Schritt bei 72 °C für 10 min. Halten Sie die PCR-Produkte bei 4 °C im Cycler bis zur Entfernung zur Weiterverarbeitung.
  9. Nach der PCR-Verstärkung die Produkte sofort reinigen und analysieren oder über Nacht bei +2 bis +8 °C lagern. Alternativ kann das Produkt bis zu 30 Tage bei -30 bis -16 °C gelagert werden.

2. Reinigung der PCR-Produkte

  1. Den Inkubator-Shaker auf 65 °C vorheizen.
  2. Fügen Sie für jede PCR-Reaktion 80 L 1x TE-Puffer (siehe Materialtabelle)zu den 20 L jedes PCR-Produkts aus Abschnitt 1 hinzu.
  3. Übertragen Sie das Probengemisch mit einer Mehrkanalpipette in eine PCR-Reinigungsplatte (siehe Materialtabelle).
  4. Halten Sie die Platte freigelegt und legen Sie sie in den Inkubator-Shaker, und bebrüten Sie bei 65 °C, während Sie bei 1.200 Umdrehungen für 10 min schütteln.
  5. Stellen Sie das Vakuumgerät nach der Inkubation auf 250 mbar (oder 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 in Hg) und aspirieren Sie die Lösung 15 min durch den Filter. Brunnen sollten keine Flüssigkeit mehr haben.
  6. Den Inkubator-Shaker auf 25 °C abkühlen.
  7. Schalten Sie nach der ersten Aspiration das Vakuum aus und fügen Sie jedem Bohrwert 50 L 1x TE-Puffer hinzu. Nicht mischen. Aspirieren Sie die Lösung für 10 min mit den Vakuumeinstellungen in Schritt 2.5.
  8. Trocknen Sie den Boden der Filterplatte, indem Sie sie fest auf einen Stapel Papiertücher drücken.
  9. Fügen Sie 20 L 1x TE-Puffer in die untere Mitte jedes Brunnens ein. Legen Sie die Platte in den Inkubator-Shaker und brüten Bei 25 °C beim Schütteln bei 1.200 Umdrehungen für 5 Min. ein.
  10. Übertragen Sie nach der Inkubation >15 l jeder gereinigten PCR-DNA von Schritt 2.9 auf eine frische 96-Well-PCR-Platte. Die gereinigte DNA kann direkt analysiert oder alternativ bei -30 bis -16 °C gespeichert werden, bis erforderlich.

3. FragmentGröße von PCR-Produkten

  1. Vor dem Start erlauben SIE DNA-Farbstoffkonzentrat, DNA-Gel-Matrix, DNA-Marker, DNA-Leiter und gereinigte DNA-Proben von Schritt 2 zu Gleichginieren auf Raumtemperatur für 30 min.
  2. Richten Sie die Grundierungsstation ein.
    1. Ersetzen Sie die Spritze (siehe Materialtabelle), wenn Sie eine neue Charge von Reagenzien verwenden.
    2. Stellen Sie die Grundplatte ein, lassen Sie den Hebel des Spritzenclips los und schieben Sie ihn bis zur oberen Position.
  3. Starten Sie die Größensoftware (siehe Tabelle der Materialien) und bereiten Sie den Gel-Dye-Mix vor.
  4. Wirbelfarbstoffkonzentrat für 10 s und Spin-down. Fügen Sie 25 l des Farbstoffs zu einer Gelmatrix-Durchstechflasche hinzu. Wirbel die gemischte Lösung gut und spindown.
    1. Die Gel-Farbstoff-Mischung in einen Spinfilter geben. Den Spinfilter in eine Mikrozentrifuge geben und 10 min bei Raumtemperatur bei 1.500 x g bei 20 % drehen.
      HINWEIS: Schützen Sie die Lösung mit Farbstoff vor Licht und lagern Sie sie nach Gebrauch bei 4 °C. Die Gel-Dye-Mischung kann für ca. 15 Chips verwendet werden, einmal zubereitet. Lassen Sie die Gel-Dye-Mischung vor Gebrauch auf Raumtemperatur für 30 min ausdemieren.
  5. Die Gel-Farbstoff-Mischung aufladen.
    1. Legen Sie einen neuen DNA-Chip auf die Grundierstation ein. Fügen Sie 9 L Gel-Farbstoff-Mix in die gut markierte mit "G" markiert. Bitte stellen Sie sicher, dass der Kolben an der 1 ml-Marke positioniert ist, und schließen Sie dann die Grundierungsstation.
    2. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten, bis er durch den Clip gehalten wird. Warten Sie genau 30 s und geben Sie den Clip dann los. Warten Sie 5 s, und ziehen Sie den Kolben dann langsam zurück in die 1 ml Position.
    3. Öffnen Sie die Grundierstation und fügen Sie 9 L Gel-Farbstoff-Mix in die mit "G" markierten Brunnen hinzu.
  6. Fügen Sie 5 l Marker in den mit dem Leitersymbol markierten Brunnen hinzu und fügen Sie außerdem 5 l Marker in jede der 12 Probenbohrungen ein. Lassen Sie keine Brunnen leer.
  7. Fügen Sie 1 L DNA-Leiter in den mit dem Leitersymbol markierten Brunnen hinzu. Fügen Sie in jedem der 12 Probenbrunnen 1 L PCR-Produkt (gebrauchte Brunnen) aus Schritt 3,1 oder 1 L L Reinstwasser (ungenutzte Brunnen) hinzu. Setzen Sie den Chip horizontal in den Adapter des Wirbelmischers und Wirbels für 1 min an der angegebenen Einstellung (2.400 Rpm).
  8. Legen Sie den Chip in das Bioanalyzer-Instrument ein und führen Sie den Chip innerhalb von 5 min im Instrument aus.
  9. Nachdem der Test abgeschlossen ist, entfernen Sie sofort den verwendeten Chip aus dem Instrument.
  10. Fügen Sie langsam 350 l entionisiertes Wasser in einen der Brunnen des Elektrodenreinigers. Öffnen Sie den Deckel des Bioanalysators und legen Sie den Elektrodenreiniger hinein. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie ca. 10 s. Öffnen Sie den Deckel und entfernen Sie den Elektrodenreiniger. Warten Sie weitere 10 s, damit das Wasser an den Elektroden verdunstet und schließen Sie dann den Deckel.

4. Analysieren sie die Ergebnisse der Fragmentgröße

HINWEIS: Die Referenzproben sollten von demselben thermischen Cycler und Bioanalyzer in derselben Charge mit den unbekannten Proben verstärkt und analysiert werden.

  1. Nachdem der Bioanalyzer ausgeführt wurde, exportieren Sie die Spitzendaten aus jedem Durchlauf als CSV-Tabellendatei für die nachfolgende Analyse.
  2. Starten Sie die Analysesoftware, und öffnen Sie die exportierte Csv-Spitzentabellendatei aus Schritt 4.1.
  3. Überprüfen Sie über die Registerkarte QC-Menü die Regressionslinie, die an die vier Punkte (als blaue Diamanten auf dem Diagramm dargestellt) aus den beiden Referenzbeispielen angepasst ist. DerR2-Wert der Regressionslinie sollte >0,98 (typische Werte über 0,999) sein.
  4. Überprüfen Sie über die Registerkarte Ergebnisse die Wiederholungsgröße jeder Probe, deren Fragmentlänge(n) automatisch mit der linearen Regressionsstandardkurve dargestellt wird, die von den Referenzstichproben abgeleitet wird. Die Software bietet auch die Klassifizierung jeder Probe nach verschiedenen Richtlinien.
  5. Exportieren Sie über die Registerkarte Export den Ergebnisbericht für jede Stichprobe mit den Wiederholungsnummern und der Diagnoseklassifizierung sowie eine Zusammenfassung der Beispielinformationen und des QC-Berichts für jede Ausführung.
    HINWEIS: Analysesoftware ermöglicht die Verwendung von benutzerdefinierten Klassifizierungsrichtlinien, wie Z. H. American College of Medical Genetics (ACMG) oder Clinical Molecular Genetics Society/ European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG) Richtlinien, sowie vordefinierte Klassifizierungen. Kriterien.

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Representative Results

Die Größenergebnisse der weiblichen Referenzprobe vor der Vormutation (NA20240, Wiederholungsgrößen von 30 und 80) und der vollständigen weiblichen Mutationsreferenzprobe (NA20239, Wiederholungsgrößen von 20 bzw. 200) sind in Abbildung 1A bzw. Abbildung 1Bdargestellt. In der Regel sind zwei Markerspitzen (untere Marker 50 Basenpaare [bp] und obere Marker 10.380 bp) im Fragmentgrößenprofil enthalten. Es gibt in der Regel eine Primer komplexe Spitze mit einer Größe von fast 95 bp. Durch die Referenzstichprobe kann eine lineare Regressionsstandardkurve mit vier Punkten erstellt werden, wie in Abbildung 1Cdargestellt.

Die repräsentativen Größenmerkmale klinischer Normal-, Zwischen-, Prämutations- und Vollmutationsproben sind in Abbildung 2A–Ddargestellt. Insbesondere mosaikartige Vollmutationen mit zwei erweiterten Fragmentspitzen und einem normalen Peak sind in Abbildung 2Edargestellt. In einigen weiblichen Fällen wird in den Ergebnissen der mikrofluidischen Elektrophorese nur ein Spitzenwert angezeigt, wie in Abbildung 2Fdargestellt. Dies lässt sich in diesen Fällen durch die Darstellung normaler homozygoter Allele (mit den gleichen CGG-Wiederholungszahlen in den beiden Allelen) oder die Unfähigkeit der Differenzierung heterozygoter Allele erklären, die Wiederholungszahlenunterschiede von vier oder weniger29aufweisen. Diese Ergebnisse mit einem Spitzenpunkt könnten jedoch als normal eingestuft werden, da bestätigt wurde, dass die PCR-basierte Pipeline eine robuste Amplifikation und Detektion von vollständigen Mutations- oder Vormutationsallelen ermöglicht, was die Möglichkeit falscher Negatives in in dieser Situation. Eine Art von suboptimaler Situation ist die Basisverzerrung, wie in Abbildung 2Gdargestellt, die in einigen Fällen zu mehrdeutigen oder nicht interpretierbaren Ergebnissen führen könnte. Eine solche Bedingung wird vermutet, durch eine Instrumentenproblematon verursacht zu werden. Die gemessenen Fragmentgrößen unbekannter Stichproben werden mit der linearen Regressionsstandardkurve, die aus den Referenzstichproben abgeleitet wird, aufgeplottet, um die Wiederholungsgrößen automatisch mit der Analysesoftware zu berechnen, wie in Abbildung 2Hdargestellt. Fragmentgrößen von weniger als 200 Wiederholungen werden in die standardkurve der linearen Regression interpoliert, während größere Vollmutations-Allelgrößen durch Extrapolieren entlang derselben Standardlinie gemessen werden. Die Software zeigt auch die Klassifizierung der einzelnen Proben nach verschiedenen Richtlinien.

Figure 1
Abbildung 1: Die Größenergebnisse der weiblichen Referenzproben und die entsprechende lineare Regressionskurve. (A, B) zeigen die Größenmerkmale der weiblichen Referenzprobe vor der Vormutation (NA20240, Wiederholungsgrößen von 30 und 80) und der vollständigen weiblichen Mutationsreferenzprobe (NA20239, Wiederholungsgrößen von 20 bzw. 200). Zwei Marker (unterer Marker, 50 bp und oberer Marker 10380 bp) sind im Elektrophorese-Ergebnis für jede Probe enthalten. Der Peak mit einer Größe von fast 95 bp weist auf einen Primerkomplex hin. Schwarze Pfeile geben die Spitzengröße des Primerkomplexes an, und blaue Pfeile stellen die Fragmentlänge der Referenzstichprobe dar. (C) Die lineare Regressionsstandardkurve mit vier Punkten (blaue Diamanten) aus den beiden Referenzproben ist in der Analysesoftware aufgebaut. Die horizontalen und vertikalen Achsen zeigen die berechneten CGG-Wiederholungszahlen und die gemessene Fragmentlänge in der mikrofluidischen Elektrophorese. DerR2-Wert der Regression betrug 0,99967. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die repräsentativen Ergebnisse klinischer Proben mit unterschiedlicher CGG-Wiederholungsgröße. (A–E) zeigen die repräsentativen Größenmerkmale von bioanalyzer in der Reihenfolge normal (mit Bruchlängen von 328 bp und 353 bp, entsprechend den Wiederholungszahlen von 28 und 36), zwischengeschaltet (mit Bruchlängen von 335 bp und 390 bp, entsprechend dem Wiederholungszahlen von 30 und 49), Vormutation (mit Bruchlängen von 332 bp und 439 bp, entsprechend den Wiederholungszahlen von 29 und 65), vollmutation (mit Bruchlängen von 337 bp und 1911bp, entsprechend den Wiederholungszahlen von 31 und 545) und Mosaik voll Mutationen (mit Fragmentlängen von 349 bp, 1201 bp und 2688 bp, entsprechend den Wiederholungszahlen von 33, 294 und 751) Proben. (F) stellt ein Mikrofluidische Elektrophorese-Ergebnis mit einer Mikrofluidelektrophorese (mit einer Fragmentlänge von 334 bp, entsprechend der Wiederholungszahl von 30) eines Weibchens dar, das wahrscheinlich homozygote Allele (mit den gleichen CGG-Wiederholungszahlen in den beiden Allelen) oder heterozygote Allele (mit der CGG-Wiederholungszahl unterschiede von vier oder weniger). (G) zeigt einen Typ der suboptimalen Situation, die Basisverzerrung ist. Schwarze Pfeile geben die Spitzengröße des Primerkomplexes an, und rote Pfeile stellen die Fragmentlänge der Probe dar. (H) zeigt die Hauptergebnisschnittstelle der Analysesoftware an. Die gemessenen Fragmentgrößen unbekannter Stichproben werden mit der linearen Regressionsstandardkurve aufgeplottet, um die Wiederholungsgrößen automatisch zu berechnen. Das normale Allel der in ( E)dargestellten Mosaik-Vollmutations-Weiblichen Probe wird der Standardkurve in der unteren linken Ecke des Koordinatenachsenbereichs (grün dargestellt) zugeordnet, und die größeren Vollmutationsallele (rot dargestellt) extrapoliert über die vier Standardpunkte (blaue Diamanten auf der Kurve). Die tabellarischen Abschnitte in der unteren Hälfte der Abbildung stellen die Fragmentgrößen und die entsprechende diagnostische Klassifizierung nach den gewählten ACMG-Richtliniengrenzen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

FXS ist die zweithäufigste Ursache für geistige Beeinträchtigung nach Trisomie 21, die für fast die Hälfte der X-verknüpften mentalen Retardierung30, die etwa 1 von 4.000 Männern und 1 von 8.000 Frauen betreffen kann. Noch wichtiger ist, fast 1 von 250–1.000 Weibchen tragen eine Vormutation, und diese Häufigkeit ist 1 in 250–1.600 bei Männern26,31,32,33. Da das Risiko einer CGG-Wiederholungsexpansion auf volle Mutationen bei der Übertragung von Prämutationsallelen an Nachkommen dramatisch ansteigt, z. B. von 4 %, wenn die mütterliche Wiederholungsgröße 55–59 bis 98 % beträgt, wenn die Größe 100–20014beträgt, ist die Bestimmung des CGG Wiederholungsgröße in einem größeren Bereich könnte die Diagnose von FXS und das Screening von Prämutationsträgern auf ihre Reproduktionsplanung erleichtern. Die hier eingeführte PCR-basierte Methode ist präzise, schnell und robust, um die Wiederholungssequenzen im 5'UTR des FMR1-Promotors zu verstärken und das gesamte Spektrum der CGG-Wiederholungszahlen auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument zu quantifizieren und steigern Sie seine breite Anwendung in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Störungen mit weniger Umlaufzeit und Investitionen in Ausrüstung. Das Bioanalysegerät kann sicher in niedrigen bis moderaten Durchsatztesteinstellungen für die Wiederholungsgrößenmessung eingesetzt werden. Die Ausrüstung ist viel kleiner, kostengünstiger und einfacher zu warten als andere Kapillarelektrophorese-Instrumente, wie ABI Kapillar-Genanalysatoren. Für das Screening mit hohem Volumen bietet das MultiDX-System mit bis zu 384-Proben-Modell eine umfassende Flexibilität und einen hohen Durchsatz für die Tests.

Der Test umfasst vier Hauptschritte: PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen im 5'UTR des FMR1-Promotors (PCR-Einrichtung und PCR-Verstärkung dauert fast 3,5 h), Reinigung der PCR-Produkte (dauert fast 1 h), Fragmentgröße auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument (dauert fast 1 h), und Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen mit der Analyse-Software durch Ableitung von den Referenzstandards mit bekannten Wiederholungen (dauert fast 0,5 h). Insgesamt beträgt die Wendezeit dieses Assays ca. 6 h. Für eine optimale Leistung sollten DNA-Proben gereinigt werden, um vermeintliche Störsubstanzen wie Proteine und hohe Salzkonzentrationen zu entfernen. Zusätzlich beträgt die empfohlene Menge an Eingangs-DNA 50–100 ng pro 20 l PCR-Reaktion. ES hat sich gezeigt, dass DNA-Mengen von mehr als 150 ng pro 20 l des PCR-Systems zu einer schlechten Amplifikation großer Wiederholungsallele führen. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, mindestens zwei Referenzproben mit gut charakterisierten Wiederholungsgrößen in jedem PCR-Lauf für die gleichzeitige Analyse von Wiederholungszahlen als Qualitätskontrolle und anschließende automatisierte Fragmentgröße in der Analysesoftware einzurichten. 29. In der Regel sollte derR2-Wert der linearen Regressionskurve, die aus den Referenzproben abgeleitet wird, größer als 0,98 sein. Darüber hinaus sollten die PCR-Produkte vor der mikrofluidischen Kapillarelektrophorese gereinigt werden, um die Detektionseffizienz zu verbessern. Da der PCR-Primer mit FAM-Fluoreszenz29beschriftet ist, kann die Fragmentgröße mit einem geeigneten Elektrophoresesystem (z.B. Bioanalyzer und MultiDX-System) direkt ohne zusätzliche Kennzeichnung durchgeführt werden.

Bruce E. Hayward et al. hat eine Vielzahl von Methoden zur Diagnose und Untersuchung von FXS und verwandten Erkrankungen umfassend überprüft, einschließlich DNA-basierter Assays und FMRP-Protein-Assays34. Da in den meisten Fällen die molekulare Basis von FXS eine dynamische Mutation ist, die durch eine Expansions-CGG-Wiederholung in der Promotorregion des FMRP1-Gens gekennzeichnet ist, sind Southern Blotting und Amplifikations-basierte Assays mit genomischer DNA die am häufigsten verwendeten Assays für Bestimmung der Wiederholungszahl. Es ist allgemein bekannt, dass PCR-basierte Assays die südliche Blotting in Derkostenwirksamkeit und minimale DNA-Menge Anforderung überwiegen. Die Verstärkung des CGG-Repeat ist jedoch eine Hauptherausforderung, da hohe GC-Gehalte die Effizienz beeinträchtigen können und im Laufe der Jahre viel für die Optimierung des PCR-Systems unternommen wurde34. Das fragile X PCR Kit wurde für die genaue Verstärkung der gesamten CGG-Trinukleotid-Wiederholungen optimiert, und eine Validierungsstudie über die Leistung dieser PCR-basierten Methode wurde zuvor von unserer Gruppe29berichtet. Eine ähnliche PCR-basierte Methode wurde von Mailick Seltzer et al. im Jahr 201235berichtet, aber das ABI 3730xl Instrument wurde für die Wiederholungsgröße Bestimmung verwendet und nur Personen mit Wiederholungsgröße weniger als 200 wurden identifiziert. Dies kann daran liegen, dass ihre gewählte Plattform nicht in der Lage war, die größeren Wiederholungen mit einer Wiederholungsgröße über 200 zu erkennen. Im Gegensatz dazu bietet das von uns verwendende Bioanalysegerät einen robusteren Fragmentgrößentest, da es das gesamte Spektrum der FMR1 CGG-Wiederholung einschließlich voller Mutationen genau und kostengünstig erkennen kann29.

Außer Wiederholungszahl müssen auch mehrere andere Faktoren für eine angemessene Diagnose von FXS- und FXS-bedingten Störungen, einschließlich FMR1-Mutation, das Ausmaß der Methylierung und des Mosaikismus34,ermittelt werden. Der Methylierungsstatus kann mit verschiedenen Methoden überwacht werden, wie z. B. der Einbeziehung von Vorverdauungsschritten mit methylierungsempfindlichem Restriktionsenzym oder Demulfitmodifikationstest34, aber unser Assay ist nicht in der Lage, die Methylierungsstatus der 5'UTR des FMR1-Promotors. Darüber hinaus hängt das Expansionsrisiko eines FMR1-Allels auch vom Vorhandensein von AGG-Unterbrechungen ab, die das Gen während der Übertragung stabilisieren können. PCR-basierte Wiederholungstests wurden modifiziert, um AGG-Unterbrechungen zu erkennen, während die Instabilität des Verdauungsenzyms eine der Haupteinschränkungen darstellt. Triplet-primed (TP) PCR mit einer hybriden PCR-Primerbindung in CGG-Wiederholungen oder AGG-Unterbrechungen ist eine andere Art von PCR-Assay, der CGG-Wiederholungsgröße und AGG-Unterbrechungen gleichzeitig erkennen kann. Die von uns beschriebene Gen-spezifische PCR-Methode FMR1 kann die AGG-Unterbrechungen jedoch nur identifizieren, wenn die FMR1-Gensequenzierung nach der Amplifikation erfolgt. Vor kurzem berichteten Hayward et al. über die PCR-Methoden, die in ihrem eigenen Labor zur Bestimmung aller Parameter verwendet werden, die für eine vollständige genetische Aufarbeitung oder gründliche Laborstudie erforderlich sind, einschließlich Assays, die Wiederholungszahlen, AGG-Unterbrechungsstatus und Methylierungsstatus36. Leider ist keiner der beiden Assay in der Lage, all diese Faktoren auf dem neuesten Stand zu halten.

Es ist erwähnenswert, dass der Test nicht in der Lage ist, Deletionen oder Single-Nukleotid-Varianten innerhalb des FMR1-Gens zu erkennen, das etwa 1% der FXS-Fälle27ausmacht. Selten, bei Personen, die zellulären Mosaikismus für die FMR1-Wiederholung haben, PCR kann ein falsch negatives Ergebnis geben, weil es bei der Erkennung von Mosaikismus für größere Prämutation und Vollmutation alleles37,38. Es wurde gezeigt, dass der Schwellenwert dieses PCR-basierten Assays für Mosaik-Vollmutations-Männchenprobe (341 Wiederholungen) 2,5 % beträgt, wenn der Schwellenwert für den Spitzendetektor auf drei Fluoreszenzeinheiten über dem Ausgangswert29festgelegt wird. In den Fällen, in denen Mosaikallele angezeigt werden, wird eine Südfleckanalyse empfohlen. Darüber hinaus hat eine frühere Studie in Bezug auf die Elektrophorese-Plattformen gezeigt, dass das Bioanalysegerät im Vergleich zu kapillaren Elektrophoresesystemen (z. B. ABI 3130XL-Instrument) nicht in der Lage ist, die normale homozygote weibliche Proben mit einzelnen Fragmentspitzen aus weiblichen Proben mit heterozygoten Wiederholungsgrößen, die Wiederholungszahlenunterschiede von vier oder weniger29aufweisen. Diese Single-Peak-Proben könnten jedoch als normal eingestuft werden, da bestätigt wurde, dass diese PCR-basierte Pipeline eine robuste Amplifikation und detektion von vollständigen Mutations- oder Vormutationsallelen ermöglicht, was die Möglichkeit falscher Negatives in in dieser Situation. Ungeachtet der oben genannten Einschränkungen kann die Methode als First-Tier-Pipeline zur molekularen Identifizierung von FXS- und Fragile X-assoziierten Krankheiten mit Wirtschaftlichkeit, Robustheit und schneller Berichtszeit genutzt werden, ergänzt durch die Sequenzierung der FMR1-Gen und Southern Blot-Analyse der Methylierungswerte.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch Stipendien des NSFC Emergency Management Project (Grant No. 81741004), der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), des Großen Forschungsplans der Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Grant-Nr. AB16380219), dem China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) und der Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

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Genetik Ausgabe 151 Polymerase-Kettenreaktion mikrofluidische Kapillarelektrophorese Cytosin-Guanin-Guanin-Wiederholungen Trinukleotid Fragile X mentale Retardierung-1 Promotor fragiles X-Syndrom volle Mutation Prämutation
Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen
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Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung,… More

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

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