एक सटीक और मजबूत polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया आधारित परख cytosine-guanine-guanine trinucleotide नाजुक एक्स मानसिक मंदता में दोहराता है के लिए-1 जीन आणविक निदान और नाजुक एक्स सिंड्रोम और नाजुक एक्स से संबंधित की स्क्रीनिंग की सुविधा कम बारी के आसपास समय और उपकरणों में निवेश के साथ विकारों.
नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS) और जुड़े विकारों साइटोसाइन-गुआनीन (सीजीजी) trinucleotide दोहराने के विस्तार के कारण कर रहे हैं 5′ untranslated क्षेत्र (UTR) के नाजुक एक्स मानसिक मंदता-1(FMR1) जीन प्रमोटर. परंपरागत रूप से, एक आनुवंशिक विश्लेषक पर केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस टुकड़ा विश्लेषण FMR1के CGG दोहराता के आकार के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अतिरिक्त दक्षिणी दाग विश्लेषण सटीक माप के लिए आवश्यक है जब दोहराने की संख्या 200 से अधिक है. यहाँ, हम FMR1के CGG दोहराता के परिमाणीकरण के लिए एक सटीक और मजबूत बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं। इस परीक्षण का पहला चरण एक नाजुक एक्स पीसीआर किट का उपयोग कर FMR1 प्रमोटर के 5’UTR में दोहराने दृश्यों की पीसीआर प्रवर्धन है, पीसीआर उत्पादों की शुद्धि और एक microfluidic केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस साधन पर आकार टुकड़ा द्वारा पीछा किया, और CGG की संख्या के बाद व्याख्या विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ज्ञात दोहराता के साथ मानकों को संदर्भित करके दोहराता है. इस पीसीआर आधारित परख reproduible और FMR1 प्रमोटरों की CGG दोहराता की पूरी श्रृंखला की पहचान करने में सक्षम है, 200 से अधिक की एक दोहराने की संख्या के साथ उन सहित (पूर्ण उत्परिवर्तन के रूप में वर्गीकृत), 55 से 200 (पूर्वागम), 46 से 54 (मध्यस्थ), और 10 करने के लिए 45 (सामान्य).। यह एक लागत प्रभावी तरीका है कि मजबूतता और तेजी से रिपोर्टिंग समय के साथ FXS और नाजुक एक्स संबद्ध विकारों के वर्गीकरण की सुविधा है.
नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS) और नाजुक एक्स जुड़े विकारों, जैसे, कंपन और ataxia सिंड्रोम (FX-TAS), और प्राथमिक डिम्बग्रंथि कमी (FX-POI) मुख्य रूप से साइटोसाइन-गुआनीन -guanine (CGG) trinuctide दोहराने विस्तार के कारण कर रहे हैं 5′ untranslated क्ष27.31,2पर नाजुक X मानसिक मंदन-1 (एफएमआर1) जीन का क्षेत्र (UTR ) . FMR1 एनकोडेड प्रोटीन (FMRP) एक polyribosome संबद्ध आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन है कि न्यूरॉन विकास और synaptic प्लास्टिक में कार्य करता है वैकल्पिक splicing को विनियमित करने के द्वारा, स्थिरता, और MRNA या नियमन संश्लेषण के डेन्ड्रिटिक परिवहन आंशिक पदों के प्रोटीन3,4,5,6,7.
के एक CGG दोहराने आकार के साथ गतिशील भिन्नता पूर्ण उत्परिवर्तन के रूप में वर्णित है, जो aberant hypermethylation और बाद में FMR1 प्रमोटर8के प्रतिलेखन silencing प्रेरित करता है. जिसके परिणामस्वरूप अनुपस्थिति या FMRP प्रोटीन की कमी सामान्य न्यूरॉन विकास को बाधित करती है और FXS9का कारण बनता है , विभिन्न नैदानिक लक्षणों की विशेषता, गंभीर बौद्धिक विकलांगता के लिए मध्यम सहित, विकास में देरी, अतिसक्रिय व्यवहार, खराब संपर्क और ऑटिस्टिकअभिव्यक्तियां 10,11,12. महिला FXS रोगियों में प्रस्तुति आम तौर पर पुरुषों में है कि तुलना में मामूली है. 55 से 200 और 45 से 54 तक के सीजीजी दोहराने के आकार को क्रमशः पूर्वपरिवर्तन और मध्यवर्ती स्थिति के रूप में वर्गीकृत किया गया है। अस्थिरता की उच्च डिग्री के कारण , सीजीजी एक premutation या मध्यवर्ती एलील में दोहराने आकार शायद फैलता है जब माता पिता से वंश13,14को प्रेषित . इस प्रकार, premutation alleles के साथ वाहक दोहराने के विस्तार की वजह से FXS के साथ प्रभावित बच्चों होने के उच्च जोखिम में हैं, और कुछ मामलों में, मध्यवर्ती alleles दो पीढ़ियों से अधिक पूर्ण उत्परिवर्तन रेंज के लिए अपने दोहराने के आकार का विस्तार कर सकते हैं15, 16. इसके अलावा, premutation के साथ पुरुषों को भी देर से शुरू FX-TAS17,18,19विकसित करने का खतरा बढ़ व्यक्त करते हैं, जबकि premutation महिलाओं दोनों FX-TAS और FX-POI20के लिए predisposed हैं, 21,22. हाल ही में, यह सूचित किया गया है कि विकासमेंषद विलंब और सामाजिक व्यवहार में समस्याओं के साथ ऑटिस्टिक स्पेक्ट्रम विकार बच्चों में पूर्व परिवर्तन FMR1 एलेस23,24के साथ प्रस्तुत किए जाते हैं .
सटीक सीजीजी दोहराने आकार निर्धारित करने के लिए FXS और नाजुक एक्स संबद्ध विकारों25,26के वर्गीकरण और भविष्यवाणी के लिए बहुत महत्व का है. ऐतिहासिक रूप से, सीजीजी दोहराने क्षेत्र-विशिष्ट polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) टुकड़ा आकार के साथ साथ दक्षिणी धब्बा विश्लेषण FMR1 CGG दोहराने27की आणविक रूपरेखा के लिए सोने के मानक किया गया है. हालांकि, पारंपरिक विशिष्ट पीसीआर 100 से 130 से अधिक दोहराव के साथ बड़े premutations के प्रति कम संवेदनशील है और पूर्ण उत्परिवर्तन बढ़ाना करने में असमर्थ है27,28. इसके अलावा, दोहराने आकार देने के लिए एक पारंपरिक आनुवंशिक विश्लेषक पर केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस 200 से अधिक CGG दोहराता के साथ FMR1 पीसीआर उत्पादों का पता लगाने में विफल रहता है। दक्षिणी दाग विश्लेषण दोहराने आकार की एक व्यापक रेंज के भेदभाव सक्षम बनाता है, सामान्य से पूर्ण उत्परिवर्तन दोहराने की संख्या के लिए, और व्यापक रूप से पूर्ण उत्परिवर्तन की पुष्टि के लिए इस्तेमाल किया गया है (पुरुषों में) और differentiating विषमयुग्मज alleles से एक पूर्ण उत्परिवर्तन के साथ सामान्य दोहराने आकार (महिलाओं में) के साथ जाहिरा तौर पर समयुग्मज alleles. हालांकि, दोहराव की मात्रा निर्धारित करने के लिए संकल्प सीमित है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह कदम-दर-कदम परीक्षण रणनीति श्रम-प्रधान, समय लेने वाली, और लागत-प्रभावी है।
यहाँ, हम FMR1के CGG दोहराता के परिमाणीकरण के लिए एक सटीक और मजबूत पीसीआर आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं। इस परीक्षण का पहला चरण नाजुक एक्स पीसीआर किट का उपयोग कर FMR1 प्रमोटर के 5’UTR में दोहराने दृश्यों के पीसीआर प्रवर्धन है। पीसीआर उत्पादों को शुद्ध कर रहे हैं और टुकड़ा आकार एक microfluidic केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस साधन पर किया जाता है, और CGG की संख्या के बाद व्याख्या ज्ञात दोहराता के आधार पर मानकों को संदर्भित करके विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग दोहराता है तर्क है कि पीसीआर टुकड़ा लंबाई सीधे CGG दोहराता है की संख्या के लिए आनुपातिक है. पीसीआर प्रणाली में अभिकर्मक शामिल हैं जो अत्यधिक जीसी-रिच ट्राइन्यूलाइड दोहराने क्षेत्र के प्रवर्धन को सुविधाजनक बनाते हैं। इस पीसीआर आधारित परख reproduible और FMR1 प्रमोटरों के CGG दोहराता के सभी श्रेणियों की पहचान करने में सक्षम है. यह एक लागत प्रभावी तरीका है कि आणविक निदान और FXS और नाजुक एक्स की स्क्रीनिंग में व्यापक आवेदन मिल सकता है कम बारी के आसपास समय और उपकरणों में निवेश के साथ और इस प्रकार, नैदानिक की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में उपयोग किया जा सकता है प्रयोगशालाओं.
FXS trisomy 21 के बाद बौद्धिक हानि का दूसरा सबसे आम कारण है, एक्स से जुड़े मानसिक मंदता30के लगभग एक आधे के लिए लेखांकन, जो लगभग 1 में 4,000 पुरुषों और 1 में 8,000 महिलाओं को प्रभावित कर सकता है. इससे भी महत्वपूर्ण ब?…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध NSFC आपातकालीन प्रबंधन परियोजना (ग्रेंट नंबर 81741004), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 81860272), गुआंगशी के प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन के प्रमुख अनुसंधान योजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ( अनुदान सं. AB16380219), चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (ग्रेंट नंबर 2018M630993), और गुआंगशी प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 2018GXNSFAA281067).।
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
Paper towels | |||
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |