JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

En robust polymerase Kjedere reaksjon-basert analyse for kvantifisere Cytosin-Guanin-Guanin Trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1 Gene

Published: September 16, 2019
doi:
10.3791/59963
, , , , , , , , , ,
1Central Laboratory, Bao’an Maternity and Child Health Hospital,Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology,The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute,The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism,Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao’an Maternity and Child Health Hospital,Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao’an Maternity and Child Health Hospital,Jinan University

Summary

En nøyaktig og robust polymerase Chain reaksjons BAS ert analyse for kvantifisere cytosin-Guanin-Guanin trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1-genet Letter molekylær diagnose og screening av skjøre X syndrom og skjøre X-relaterte med kortere sving rundt tid og investering i utstyr.

Abstract

Skjøre X syndrom (FXS) og tilknyttede lidelser er forårsaket av utvidelse av cytosin-Guanin-Guanin (CGG) trinucleotide gjentar i 5 ‘ uoversatt region (UTR) av skjøre X mental retardasjon-1 (FMR1) Gene promoter. Konvensjonelt, kapillær elektroforese fragment analyse på en genetisk analysator brukes for dimensjonering av CGG repetisjoner av FMR1, men ytterligere Southern blot analyse er nødvendig for nøyaktig måling når repetisjons tallet er høyere enn 200. Her presenterer vi en nøyaktig og robust polymerase kjedere reaksjons metode (PCR) basert på kvantifisering av CGG repetisjoner av FMR1. Det første trinnet i denne testen er PCR forsterkning av gjenta sekvenser i 5 ‘ UTR av FMR1 arrangøren ved hjelp av en SKJØR X PCR Kit, etterfulgt av rensing av PCR-produkter og fragment dimensjonering på en mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument, og tolkning av antall CGG-repetisjoner ved å henvise til standarder med kjente repetisjoner ved hjelp av analyseprogramvaren. Dette PCR-baserte analysen er reproduserbar og i stand til å identifisere hele spekteret av CGG repetisjoner av FMR1 arrangører, inkludert de med en gjentakelse antall mer enn 200 (klassifisert som full mutasjon), 55 til 200 (premutation), 46 til 54 (middels), og 10 til 45 (normal). Det er en kostnadseffektiv metode som forenkler klassifisering av FXS og skjøre X-assosierte lidelser med robusthet og rask rapporterings tid.

Introduction

Skjøre X syndrom (FXS) og skjøre X assosierte lidelser, f. eks, tremor og ataksi syndrom (FX-TAS), og primære eggstokkene insuffisiens (FX-POI) er hovedsakelig forårsaket av cytosin-Guanin-Guanin (CGG) trinucleotide gjenta ekspansjon i 5 ‘ uoversatt region (UTR) av den skjøre X mental retardasjon-1 (FMR1) genet på xQ 27.31,2. Den FMR1 kodet PROTEIN (FMRP) er en polyribosome-assosiert RNA-binding protein som fungerer i neuronal utvikling og Synaptic plastisitet ved å regulere alternative skjøting, stabilitet, og dendrittiske transport av mRNA eller modulerende syntese av delvis postsynaptic proteiner3,4,5,6,7.

Den dynamiske variasjonen med en CGG på > 200 er beskrevet som full mutasjon, noe som induserer den avvikende hypermethylation og påfølgende transcriptional demping av FMR1 arrangøren8. Den resulterende fravær eller mangel på FMRP protein forstyrrer normal neuronal utvikling og forårsaker FXS9, karakterisert ved ulike kliniske symptomer, inkludert moderat til alvorlig intellektuell funksjonshemming, utviklingsmessige forsinkelse, hyperaktiv atferd, fattige kontakter og autistiske manifestasjoner10,11,12. Presentasjonen i kvinnelige FXS pasienter er generelt mildere enn i menn. Det CGG gjentagelse størrelse oppstiller fra 55 å 200 og 45 å 54 er hemmelig idet premutation og mellomliggende rang, respectively. På grunn av den høye graden av ustabilitet, CGG gjenta størrelse i en premutation eller middels allel antagelig utvides når overføres fra foreldre til avkom13,14. Dermed, bærere med premutation alleler har høy risiko for å få barn rammet med FXS på grunn av gjenta ekspansjon, og i noen tilfeller kan mellomliggende alleler utvide sin gjenta størrelse til full mutasjon området over to generasjoner15, 16i den. Videre, hanner med premutation også formidle økt risiko for å utvikle sen-utbruddet FX-tas17,18,19, mens premutation kvinner er disponert for både FX-tas og FX-POI20, 21,22. Nylig har det blitt rapportert at autistiske spektrum lidelser med utviklingsmessige forsinkelser og problemer i sosial atferd er presentert hos barn med premutation FMR1 alleler23,24.

For å finne den eksakte CGG repetisjons størrelse er av stor betydning for klassifisering og prediksjon av FXS og skjøre X-tilknyttede lidelser25,26. Historisk har CGG gjenta Regionspesifikk polymerase kjedere reaksjon (PCR) med fragment dimensjonering pluss Southern blot analyse vært gullstandarden for molekylær profilering av FMR1 CGG gjenta27. Imidlertid er tradisjonell spesifikk PCR mindre følsom for store premutations med mer enn 100 til 130 repetisjoner og er ute av stand til å forsterke hele mutasjoner27,28. I tillegg kan kapillær elektroforese på en tradisjonell genetisk analysator for repetisjons dimensjonering ikke detektere FMR1 PCR-produkter med mer enn 200 CGG repetisjoner. The Southern blot analysen muliggjør differensiering av et bredere spekter av gjenta størrelse, fra normal til full mutasjon gjenta tall, og har vært mye brukt for å bekrefte hele mutasjoner (i menn) og differensiere heterozygot alleler med full mutasjon fra tilsynelatende homozygote alleler med normal gjenta størrelser (i kvinner). Imidlertid, resolusjonen for Kvantifisere det gjentar er begrenset. Enda viktigere er dette trinn-for-trinn testing strategien er arbeidskrevende, tidkrevende og kostnadseffektive.

Her presenterer vi en nøyaktig og robust PCR-basert metode for kvantifisering av CGG-repetisjoner av FMR1. Det første trinnet i denne testen er PCR forsterkning av gjenta sekvenser i 5 ‘ UTR av FMR1 promoter bruker SKJØRE X PCR Kit. PCR-produktene er renset og fragment dimensjonering utføres på et mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument, og etterfølgende tolkning av antallet CGG-repetisjoner ved hjelp av analyseprogramvaren ved å henvise til standarder med kjente repetisjoner basert på at PCR-fragment lengden er direkte proporsjonal med antallet CGG-repetisjoner. PCR-systemet omfatter reagenser som forenkler forsterkningen av det svært GC-rike trinucleotide gjentakelsesområdet. Dette PCR-baserte analysen er reproduserbar og i stand til å identifisere alle områder av CGG repetisjoner av FMR1 arrangører. Dette er en kostnadseffektiv metode som kan finne bred anvendelse i molekylær diagnose og screening av FXS og skjøre X-relaterte lidelser med mindre sving rundt tid og investeringer i utstyr og dermed kan utnyttes i et bredere spekter av kliniske Laboratorier.

Protocol

Etisk godkjenning ble gitt av Joint Chinese University of Hong Kong-nye territorier East Cluster Clinical Research etikk Committee (referansenummer: 2013,055) 1. PCR forsterkning Før start, Fjern PCR buffer mix, sample fortynningsmiddel og DNA-prøver (både test og referanse DNA) (se tabell over materialer) fra-20 ° c fryseren og oppbevar dem i romtemperatur i 20 – 30 min for å sikre at alle reagenser og DNA er fullt tint. Og snurr kort ned før bruk. <li…

Representative Results

Størrelses resultatene av den premutation kvinnelige referanse prøven (NA20240, gjenta størrelser på 30 og 80) og full mutasjon kvinnelig referanse prøve (NA20239, gjenta størrelser på 20 og 200) er vist i figur 1a og figur 1B, henholdsvis. Vanligvis er to markør topper (nedre markør 50 base parene [BP] og øvre markør 10 380 BP) inkludert i fragment størrelse profil. Det er vanligvis en primer kompleks topp med en størrelse på nesten 95 BP. Gjennom…

Discussion

FXS er den nest vanligste årsaken til intellektuell svekkelse etter Trisomi 21, sto for nesten halvparten av X-tilknyttede mental retardasjon30, som kan påvirke ca 1 av 4 000 menn og 1 av 8 000 kvinner. Enda viktigere, nesten 1 av 250-1000 kvinner bære en premutation, og denne frekvensen er 1 i 250-1600 i menn26,31,32,33. Siden risikoen for CGG gjenta ekspansjon til f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra NSFC Emergency Management Project (Grant nr. 81741004), National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81860272), den store forsknings plan av Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Gi nei. AB16380219), Kina postdoktor Science Foundation Grant (Grant no. 2018M630993), og Guangxi Natural Science Foundation (Grant no. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent PerkinElmer In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mix PerkinElmer In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase Polymerase PerkinElmer In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis software PerkinElmer
NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer Thermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate MACHEREY-NAGEL 743100
reference DNA sample Coriell NA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal Cycler Bio-Rad 1852196 This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrument PerkinElmer 1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Life Technologies 10977015 For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0256 (Model G560E) Conventional vortex mixer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d’endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene–and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Tags

PCR AssayFragile X Mental Retardation-1 GeneCGG Trinucleotide RepeatsMolecular DiagnosisFragile X SyndromeFragile X-related DisordersCost-effectiveRapid ReportingDNA Sample PreparationPCR Master MixPCR Cleanup
check_url/59963?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image