酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる
Summary
この方法は、細胞接着の初期ダイナミクスを定量化し、アンカレッジ依存性細胞をフィブロネクチンに広めるのに有用である。さらに、このアッセイは、細胞拡散および/または細胞接着関連細胞内シグナル伝達経路に対する改変された酸化還元恒常性の影響を調製するために使用することができる。
Abstract
細胞外マトリックス(ECM)への細胞の接着と広がりは、組織の発達および成人組織の恒常性のために不可欠な細胞プロセスである。興味深いことに、酸化ストレスはこれらのプロセスを変え、転移性癌などの疾患の病態生理学に寄与する。したがって、レドックス状態の摂動中に細胞がECM上でどのように付着し、広がるかを理解することは、正常および疾患状態に関する洞察を提供することができる。以下に説明するステップワイズプロトコルは、免疫蛍光ベースのアッセイを利用して、インビトロでのフィブロネクチン(FN)上の不死化線維芽細胞の細胞接着および広がりを特異的に定量する。簡単に言えば、アンカレッジ依存細胞は懸濁液中に保持され、酸化ストレスを誘発するためにATMキナーゼ阻害剤Ku55933に曝露される。その後、細胞をFNコーティング面にめっきし、所定の期間付着させた。付着したままの細胞は、接着の蛍光ベースの抗体マーカー(例えば、パクシリン)および広がり(例えば、F-アクチン)で固定され、標識される。データの取得と分析は、エピ蛍光顕微鏡や自由に入手可能なフィジーソフトウェアを含む一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。この手順は非常に汎用性が高く、様々な細胞株、ECMタンパク質、または阻害剤に対して改変して、幅広い生物学的疑問を調べることができます。
Introduction
細胞マトリックス接着(すなわち、焦点接着)は、細胞の接着および広がりを媒通する大きく、動的な多分子タンパク質複合体である。これらのプロセスは、組織の発達、維持、および生理機能に不可欠です。焦点接着は、インテグリンなどの膜結合受容体と、細胞骨格アクチンを細胞外マトリックス(ECM)1にリンクする足場タンパク質で構成される。これらの複合体は、様々なシグナル伝達伝達経路の活性化を通じて細胞外環境に存在する生理学的手がかりに応答することができる。したがって、焦点接着は、指向性移行、細胞周期調節、分化、および生存1、2を含む多くの細胞プロセスに細胞外機械的手掛かりを伝播するシグナル伝達センターとして機能する。焦点接着を調節し、相互作用するシグナル伝達分子の1つのグループは、小さなGTPasesのRhoファミリーのメンバーを含みます。Rho GTPasesは、その特定の時空間活性化3を介して細胞移動および接着力力学を調節する主要なタンパク質である。当然のことながら、Rhoタンパク質機能の調節不全は、転移、血管新生、および他の人の病理学の数に関与している。特に興味深いのは、細胞還元状態が細胞移動および接着の調節において主な役割を果たす。活性酸素種(ROS)の増加などの酸化還元恒常性の変化は、Rhoタンパク質活性、ならびに接着性を調節することが実証されており、多くの細胞型およびヒト疾患4、5、6 、7、8.例えば、DNA損傷修復セリン/スレオニンキナーゼA-T変異(ATM)の変異によって引き起こされる神経障害運動失調性毛症-毛器形成症(A-T)に苦しむ個人は、転移性癌9のリスクが高い。 10.これらの患者および細胞株におけるATMキナーゼ活性の喪失は、遺伝的変異または化学阻害のいずれかを通じて、ペントースリン酸経路の機能不全による高レベルの酸化ストレスをもたらす7,11、 12.さらに、研究室からの最近の研究は、細胞骨格ダイナミクス(すなわち接着および広がり)をインビトロ5で活性化した直接的な結果として、A-TにおけるROSの病態生理学的役割を強調している。最終的に、Rhoファミリー活性化によって引き起こされる細胞骨格ダイナミクスのこれらの変化は、A-T患者5、13に記載された転移癌のリスクの増加につながる可能性がある。したがって、酸化ストレス中の細胞マトリックス相互作用の相互作用を理解することは、接着と広がりの調節に関する洞察を提供することができる。これらの研究はまた、これらのシグナル伝達プロセスにおけるRhoファミリーGTPasesの可能な役割に関するさらなる調査の段階を設定することができます。
ここに記載されているのは、ATMキナーゼ活性の阻害によって引き起こされる酸化ストレス中の接着アセンブリおよび広がりの初期細胞ダイナミクスを研究するためのプロトコルである。このアッセイは、ECMタンパク質フィブロネクチン(FN)へのアンカレッジ依存性細胞の接着の十分に特徴付けられたメカニズムに基づいている。懸濁液中で維持された細胞がFN上にメッキされると、いくつかのRho GTPasesは、アクチン細胞骨格リモデリング3、14の制御を調整する。形態学的変化は、細胞が円形と円形から平坦化および膨張にシフトするにつれて観察される。これらの観察と一致することは、ECMとの多数のマトリックス接着の開発である。これらの変化は、細胞が付着して15、16に広がるにつれて、最初の1時間の間にRac1を用いたRhoAの二葉性活性化に起因する。
細胞の拡散と同様に接着形態やダイナミクスを調べるために、様々な方法が利用されている。しかし、これらの方法は、高度な長期ライブイメージング全内部反射蛍光(TIRF)または共焦点顕微鏡システムに依存しています。したがって、ユーザーは、特殊な機器やソフトウェアへのアクセス権を持っている必要があります。さらに、これらのバイオイメージングシステムに必要なセットアップ時間は、特に複数の阻害剤または治療条件を同時にテストする場合に、早期接着イベントの捕捉を困難にします。
本明細通り、詳細な方法は、接着アセンブリおよびインビトロで広がるパラメータを評価する、簡単で経済的でありながら定量的な方法を提供する。このプロトコルは、エピ蛍光顕微鏡やCCDカメラなどの一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。このアッセイは、以前に実証されたATMキナーゼ活性の化学阻害によって引き起こされる酸化ストレスの期間後にFN被覆表面にアンカレッジ依存細胞を適用することを含む5。メッキに続いて、細胞は、指定された時間の長さのために付着し、付着することが可能です。未接続の細胞は洗い流され、付着した細胞は固定され、接着のマーカー(例えば、パクシリン)および広がる(例えば、F-アクチン)2、5に蛍光ベースの抗体で標識される。これらのタンパク質を視覚化し、エピ蛍光顕微鏡を使用して記録します。その後のデータ分析は、自由に利用可能なフィジーソフトウェアを使用して実行されます。さらに、この方法は、異なるECMタンパク質、様々な酸化剤/細胞培養条件による治療、または様々なアンカレッジ依存性細胞株を含む幅広い条件下で接着力を調べ、幅広い範囲に対応することができます。生物学的な質問。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、細胞拡散中の動的細胞骨格リモデリングのための多数のアンカレッジ依存性細胞型を迅速にスクリーニングする汎用性と経済的な方法である。特に、この方法は、細胞がFNに付着した場合の酸化ストレス時の応力繊維および焦点接着形成を定量的に調べる(図1A)。さらに、これらの細胞型は、細胞の付着および15、16、22の間に役割を文書化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、スコット・R・ハットン博士とメーガン・S・ブラックレッジ博士に原稿の批判的なレビューに感謝しています。この研究は、ハイポイント大学の研究とスポンサープログラム(MCS)とノースカロライナ州立大学のバイオテクノロジープログラム(MCS)によって資金提供されました。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
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