세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산
Summary
이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Abstract
세포 외 매트릭스 (ECM)에 세포의 접착 그리고 퍼짐은 유기체 발달 도중 및 성인 조직의 항상성에 대한 필수적인 세포 과정입니다. 흥미롭게도, 산화 스트레스는 이러한 과정을 변경할 수 있습니다., 따라서 전이성 암 같은 질병의 병 리 생리학에 기여. 따라서, 세포가 산화되는 동안 ECM에 부착되고 퍼지는 방법의 메커니즘을 이해하면 정상 및 질병 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아래에 기재된 단계별 프로토콜은 면역형광계 분석기를 사용하여 시험관내 섬유넥틴(FN)에 불멸의 섬유아세포 세포의 세포 부착 및 확산을 구체적으로 정량화하는 것이다. 간략하게, 앵커리지 의존성 세포는 산성 스트레스를 유도하기 위해 ATM 키나제 억제제 Ku55933에 노출되고 현탁액에 보유된다. 세포는 FN 코팅 된 표면에 도금되고 소정의 기간 동안 부착 할 수 있습니다. 부착된 상태로 남아 있는 세포는 부착(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)의 형광 계 항체 마커로 고정및 표지된다. 데이터 수집 및 분석은 epifluorescence 현미경 및 자유롭게 사용할 수 있는 피지 소프트웨어를 포함하여 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 절차는 매우 다재다능하고 다양한 세포주, ECM 단백질, 또는 억제제에 대해 광범위한 생물학적 질문을 검사하기 위해 변형될 수 있다.
Introduction
세포 매트릭스 접착 (즉, 초점 접착)은 세포 접착 및 확산을 중재하는 크고 역동적 인 다분자 단백질 복합체입니다. 이러한 프로세스는 조직 개발에 대 한 중요 한, 유지 보수, 그리고 생리 기능. 국소 유착은 세포외 기질 (ECM)에 세포골격 액틴을 연결하는 스캐폴딩 단백질뿐만 아니라 인테그린과 같은 막 결합 수용체로 구성된다1. 이러한 복합체는 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 통해 세포 외 환경에 존재하는 물리 화학 적 단서에 반응 할 수있다. 이와 같이, 초점 유착은 지시된 이동, 세포 주기 규칙, 분화 및생존을포함하는 다수의 세포 과정으로 세포 외 기계적 단서를 전파하는 신호 센터로서 역할을 한다1,2. 초점 유착을 조절하고 상호 작용하는 신호 분자의 한 그룹은 작은 GTPases의 Rho 가족의 구성원을 포함합니다. Rho GTPases는 그들의 특정 spatiotemporal 활성화3를 통해 세포 이동 및접착 역학을 통제하는 중요한 단백질입니다. 당연히, Rho 단백질 기능의 dysregulation는 전이, 혈관 신생 및 그 외와 같은 인간적인 병리의 수에서 연루되었습니다. 특히, 세포 산화 상태는 세포 이동 및 접착의 변조에 지배적 인 역할을한다. 반응성 산소 종(ROS)의 증가와 같은 레독스 항상성의 변화는 다수의 세포 유형 및 인간 질병에서 로단백질 활성뿐만 아니라 유착을 조절하는 것으로 입증되었다4,5,6 ,7,8. 예를 들어, DNA 손상 수리 세린/트레오닌 키나아제 A-T 돌연변이(ATM)의 돌연변이에 의해 야기되는 신경장애 운동실조-말실증(A-T)을 앓고 있는 개인은 전이성 암의 위험이 증가합니다9. 10. 이러한 환자와 세포주에서 ATM 키나아제 활성의 손실은 유전적 돌연변이 또는 화학적 억제를 통해, 펜토스 인산통로의 기능 장애로 인한 높은 수준의 산화 스트레스를 초래한다7,11, 12. 더욱이, 실험실에서 최근 연구는 시험관에서 Rho 가족 GTPases를 활성화의 직접적인 결과로 세포골격 역학 (즉, 접착 및 확산)을 변경하여 A-T에서 ROS에 대한 병리생리학적 역할을 강조했다5. 궁극적으로, 로가족 활성화에 의한 세포골격역학의 이러한 변화는 A-T 환자5,13에서언급한 전이성 암의 위험 증가로 이어질 수 있다. 따라서 산화 스트레스 동안 세포 매트릭스 상호 작용 간의 상호 작용을 이해하면 접착 및 확산 의 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 연구는 또한 이러한 신호 프로세스에서 Rho 가족 GTPases에 대 한 가능한 역할에 대 한 추가 조사를 위한 무대를 설정할 수 있습니다.
본원에 기재된 프로토콜은 ATM 키나아제 활성의 억제에 의해 야기된 산화 스트레스 동안 유착 어셈블리 및 확산의 초기 세포 역학을 연구하는 프로토콜이다. 이러한 분석은 ECM 단백질 피브로넥틴(FN)에 대한 앵커리지 의존성 세포의 잘 특성화된 기전을 기반으로 한다. 현탁액에서 유지되는 세포가 FN 상에 도금되면, 몇몇 Rho GTPases는 액틴 시토스켈레탈 리모델링3,14의제어를 조정한다. 형태학적 변화는 세포가 원형과 원형의 원형에서 평평해지고 팽창하는 것으로 이동함에 따라 관찰됩니다. 이러한 관찰과 수반되는 것은 ECM과 수많은 매트릭스 유착의 개발이다. 이러한 변화는 세포가 15,16을부착하고 확산함에 따라 첫 번째 시간 동안 Rac1을 가진 RhoA의 양면 활성화에 기인합니다.
세포 확산뿐만 아니라 접착 형태및 역학을 검사하기 위해 다양한 방법이 활용되었습니다. 그러나, 이 방법은 정교한 장기, 살아있는 화상 진찰 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 공초점 현미경 검사법에 의존합니다. 따라서 사용자는 특수 장비 및 소프트웨어에 액세스할 수 있어야 합니다. 또한, 이러한 바이오 이미징 시스템에 필요한 설정 시간은 특히 여러 억제제 또는 치료 조건을 동시에 테스트할 때 초기 접착 이벤트를 포착하는 데 어려움을 겪고 있습니다.
본 명세서에서 상세한 방법은, 접착 어셈블리및 시험관 내 확산을 제어하는 파라미터를 평가하는 간단하고 경제적이면서도 정량적인 방법을 제공한다. 프로토콜은 상피 현미경 및 CCD 카메라와 같은 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 분석법은 ATM 키나아제 활성의 화학적 억제에 의한 산화 스트레스의 기간 후에 FN 코팅 된 표면에 앵커리지 의존 세포를 적용하는 것을 포함하며, 이는 이전에 입증된5. 도금 후, 셀은 지정된 시간 동안 부착및 부착할 수 있습니다. 부착되지 않은 세포는 부착된 세포가 부착의 마커(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)에 형광계 항체로 고정및 표지되는 동안2,5. 이 단백질은 그 때 epifluorescence 현미경을 사용하여 구상되고 기록됩니다. 후속 데이터 분석은 자유롭게 사용할 수있는 피지 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 더욱이, 이 방법은 다양한 ECM 단백질, 다양한 산화제/세포 배양 조건 또는 다양한 앵커리지 의존성 세포주를 포함하는 광범위한 조건 하에서 접착 역학을 검사하는 데 적용될 수 있다. 생물학적 질문.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명된 프로토콜은 세포 확산 동안 동적 세포골격 리모델링을 위한 다수의 앵커리지 의존성 세포 유형을 신속하게 스크리닝하는 다목적및 경제적인 방법입니다. 특히, 이 방법은 세포가 FN에 부착될 때 산화 스트레스 동안 응력 섬유 및 국소 접착 형성을 정량적으로 검사한다(도1A). 더욱이, 이들 세포 표현형은 세포 부착 및 확산15,<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 스콧 R. 허튼 박사와 메건 S. 블랙레지 박사가 원고에 대한 비판적 검토에 감사를 표한다. 이 작품은 하이 포인트 대학의 연구 및 후원 프로그램에 의해 투자되었다 (MCS) 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 생명 공학 프로그램 (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
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