Examen de la dinámica de la adhesión celular y la propagación de células epiteliales en la fibronectina durante el estrés oxidativo
Summary
Este método es útil para cuantificar la dinámica temprana de la adhesión celular y la propagación de células dependientes del anclaje en la fibronectina. Además, este ensayo se puede utilizar para investigar los efectos de la homeostasis redox alterada en la propagación celular y/ o vías de señalización intracelular relacionadas con la adhesión celular.
Abstract
La adhesión y propagación de las células a la matriz extracelular (ECM) son procesos celulares esenciales durante el desarrollo del organismo y para la homeostasis de los tejidos adultos. Curiosamente, el estrés oxidativo puede alterar estos procesos, contribuyendo así a la fisiopatología de enfermedades como el cáncer metastásico. Por lo tanto, comprender los mecanismos de cómo las células se unen y se propagan en el ECM durante las perturbaciones en el estado de redox puede proporcionar información sobre los estados normales y de la enfermedad. A continuación se describe un protocolo escalonado que utiliza un ensayo basado en inmunofluorescencia para cuantificar específicamente la adhesión celular y la propagación de células fibroblastas inmortalizadas en fibronectina (FN) in vitro. Brevemente, las células dependientes del anclaje se mantienen en suspensión y se exponen al inhibidor de la quinasa ATM Ku55933 para inducir estrés oxidativo. Las celdas se chapan en la superficie recubierta de FN y se les permite fijar se adhieren durante períodos de tiempo predeterminados. Las células que permanecen unidas se fijan y se etiquetan con marcadores de adhesión a base de fluorescencia (por ejemplo, paxillina) y propagación (por ejemplo, F-actina). La adquisición y el análisis de datos se realizan utilizando equipos de laboratorio comúnmente disponibles, incluido un microscopio de epifluorescencia y software de Fiji disponible libremente. Este procedimiento es muy versátil y se puede modificar para una variedad de líneas celulares, proteínas ECM, o inhibidores con el fin de examinar una amplia gama de preguntas biológicas.
Introduction
Las adherencias de matriz celular (es decir, adherencias focales) son complejos proteicos multimoleculares grandes y dinámicos que median la adhesión y la propagación celular. Estos procesos son críticos para el desarrollo de tejidos, el mantenimiento y la función fisiológica. Las adherencias focales se componen de receptores ligados a la membrana, como integrinas, así como proteínas de andamios que vinculan la actina citoesquelética con la matriz extracelular (ECM)1. Estos complejos son capaces de responder a las señales fisioquímicas presentes en el entorno extracelular a través de la activación de varias vías de transducción de señalización. Como tal, las adherencias focales sirven como centros de señalización para propagar señales mecánicas extracelulares en una serie de procesos celulares, incluyendo migración dirigida, regulación del ciclo celular, diferenciación y supervivencia1,2. Un grupo de moléculas de señalización que regulan e interactúan con adherencias focales incluye miembros de la familia Rho de pequeñas GTPases. Rho GTPases son proteínas clave que regulan la migración celular y la dinámica de adhesión a través de su activación espaciotemporal específica3. No es sorprendente, la desregulación de la función de la proteína Rho se ha implicado en un número de patologías humanas como metástasis, angiogénesis, y otros. De particular interés, el estado celular de redox desempeña un papel predominante en la modulación de la migración y adhesión celular. Se ha demostrado que las alteraciones en la homeostasis redox, como los aumentos de las especies reactivas de oxígeno (ROS), regulan la actividad de la proteína Rho, así como la adhesión, en varios tipos de células y enfermedades humanas4,5,6 ,7,8. Por ejemplo, las personas que sufren del trastorno neurológico ataxia-telangiectasia (A-T), que es causada por una mutación en la reparación del daño del ADN serina/threonina quinasa A-T-mutada (ATM), tienen un mayor riesgo de cáncer metastásico9, 10. La pérdida de actividad de la quinasa ATM en estos pacientes y líneas celulares, ya sea a través de mutación genética o inhibición química, resulta en altos niveles de estrés oxidativo debido a la disfunción de la vía del fosfato de pentosa7,11, 12. Además, estudios recientes del laboratorio han puesto de relieve un papel fisiopatológico de ROS en A-T alterando la dinámica citoesquelética (es decir, la adhesión y la propagación) como resultado directo de la activación de la familia Rho GTPases in vitro5. En últimainstancia, estas alteraciones en la dinámica citoesquelética causada por la activación de la familia Rho pueden conducir al mayor riesgo de cáncer metastásico observado en pacientes con A-T5,13. Por lo tanto, comprender la interacción entre las interacciones entre la matriz celular durante el estrés oxidativo puede proporcionar información sobre la regulación de la adhesión y la propagación. Estos estudios también pueden sentar las bases para más investigaciones sobre un posible papel para la familia Rho GTPases en estos procesos de señalización.
Descrito aquí es un protocolo para estudiar la dinámica celular temprana del ensamblaje de adhesión y la propagación durante el estrés oxidativo causado por la inhibición de la actividad de la quinasa ATM. Este ensayo se basa en el mecanismo bien caracterizado de adhesión de las células dependientes del anclaje a la fibronectina proteica ECM (FN). Cuando las células mantenidas en suspensión se chapan en FN, varias Rho GTPases coordinan el control de la remodelación citoesquelética actina3,14. Los cambios morfológicos se observan a medida que las células cambian de redonda y circular en apariencia a aplanadas y expandidas. Concomitante con estas observaciones es el desarrollo de numerosas adherencias de matriz con el ECM. Estos cambios se atribuyen a la activación bifásica de RhoA con Rac1 durante la primera hora a medida que las células se adhieren y se extienden 15,16.
Se han utilizado una variedad de métodos para examinar la morfología y la dinámica de adhesión, así como la propagación celular. Sin embargo, estos métodos se basan en sofisticados sistemas de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) a largo plazo, imágenes en vivo o sistemas de microscopía confocal. Por lo tanto, los usuarios deben tener acceso a equipos y software especializados. Además, el tiempo de configuración requerido por estos sistemas de bioimágenes hace que la captura de eventos de adhesión temprana sea un reto, especialmente cuando se prueban múltiples inhibidores o condiciones de tratamiento simultáneamente.
Los métodos detallados, aquí, proporcionan una forma directa, económica y cuantitativa de evaluar los parámetros que rigen el ensamblaje de adhesión y la propagación in vitro. El protocolo se realiza utilizando equipos de laboratorio comúnmente disponibles, como un microscopio de epifluorescencia y una cámara CCD. Este ensayo implica la aplicación de células dependientes del anclaje a una superficie recubierta de FN después de un período de estrés oxidativo causado por la inhibición química de la actividad de la quinasa ATM, que se ha demostrado previamente5. Después del revestimiento, las celdas se pueden unir y adherir durante períodos de tiempo especificados. Las células no conectadas se lavan, mientras que las células adheridas se fijan y etiquetan con anticuerpos basados en fluorescencia a marcadores de adhesión (por ejemplo, paxillina) y que se propagan (por ejemplo, F-actina)2,5. Estas proteínas se visualizan y registran mediante un microscopio de epifluorescencia. El análisis de datos posterior se realiza utilizando el software de Fiji disponible libremente. Además, este método se puede adaptar para examinar la dinámica de adhesión en una amplia gama de condiciones, incluyendo diferentes proteínas ECM, tratamiento con diversos oxidantes /condiciones de cultivo celular o una variedad de líneas celulares dependientes del anclaje para abordar una amplia gama de preguntas biológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí es una forma versátil y económica de examinar rápidamente una serie de tipos de células dependientes del anclaje para la remodelación dinámica del citoesqueleto durante la propagación celular. En particular, este método examina cuantitativamente la fibra de tensión y la formación de adherencia focal durante el estrés oxidativo cuando las células se adhieren a FN(Figura 1A). Además, estos fenotipos celulares pueden sugerir un papel regulador para los m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los Doctores Scott R. Hutton y Meghan S. Blackledge por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por los Programas de Investigación y Patrocinados de la Universidad de High Point (MCS) y el Programa de Biotecnología de la Universidad Estatal de Carolina del Norte (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
