Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması
Summary
Bu yöntem, hücresel yapışmanın erken dinamiklerini ölçmek ve ankraja bağlı hücrelerin fibronektin üzerine yayılması için yararlıdır. Ayrıca, bu tetkik hücre yayılımı ve / veya hücre adezyonu ile ilgili hücre içi sinyal yolları üzerinde değişmiş redoks homeostaz etkilerini araştırmak için kullanılabilir.
Abstract
Hücrelerin hücre dışı matrikse (ECM) yapışması ve yayılması, organizma gelişimi ve erişkin dokuların homeostazisi sırasında ki temel hücresel süreçlerdir. İlginçtir, oksidatif stres bu süreçleri değiştirebilir, böylece metastatik kanser gibi hastalıkların patofizyolojisine katkıda. Bu nedenle, redoks durumundaki tedirginlikler sırasında hücrelerin ECM’ye nasıl bağlanıp yayıldığı mekanizmasını anlamak normal ve hastalık durumlarına ışık verebilir. Aşağıda açıklanan bir immünofloresan tabanlı test özellikle hücre adezyonu ölçmek ve fibronektin üzerinde ölümsüzleştirilmiş fibroblast hücrelerinin yayılmasını kullanan bir adım-bilge protokoldür (FN) in vitro. Kısaca, ankraja bağımlı hücreler süspansiyon da tutulur ve oksidatif strese neden olmak için ATM kinaaz inhibitörü Ku55933 maruz kalır. Hücreler daha sonra FN kaplı yüzeye kaplanır ve önceden belirlenmiş süreler için bağlanmasına izin verilir. Bağlı kalan hücreler sabit ve yapışma esaslı antikor belirteçleri ile etiketlenir (örneğin, paxillin) ve yayılan (örneğin, F-aktin). Veri toplama ve analiz, epifloresan mikroskobu ve serbestçe kullanılabilen Fiji yazılımı da dahil olmak üzere yaygın olarak bulunan laboratuvar ekipmanları kullanılarak gerçekleştirilir. Bu prosedür çok yönlüdür ve çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için çeşitli hücre hatları, ECM proteinleri veya inhibitörleri için değiştirilebilir.
Introduction
Hücre-matriks yapışıklıkları (yani fokal yapışıklıklar) hücre yapışıklığı ve yayılmasına aracılık eden büyük ve dinamik multimoleküler protein kompleksleridir. Bu süreçler doku gelişimi, bakımı ve fizyolojik fonksiyonu için çok önemlidir. Fokal yapışıklıklar integrinler gibi membrana bağlı reseptörlerin yanı sıra sitoskeletal aktini hücre dışı matrikse (ECM)1’ebağlayan iskele proteinlerinden oluşur. Bu kompleksler çeşitli sinyal iletim yollarının aktivasyonu yoluyla hücre dışı ortamda mevcut fizyokimyasal ipuçlarına yanıt verme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, odak yapışıklıkları yönlendirilmiş göç, hücre döngüsü düzenleme, farklılaşma ve sağkalım1dahil olmak üzere hücresel süreçlerin bir dizi içine hücre dışı mekanik ipuçları yaymak için sinyal merkezleri olarak hizmet vermektedir ,2. Odak yapışıklıklarını düzenleyen ve onlarla etkileşime girerek sinyal moleküllerinin bir grup küçük GTPases Rho ailesinin üyeleri içerir. Rho GTPases kendi özel spatiotemporal aktivasyon yoluyla hücre göçü ve yapışma dinamikleri düzenleyen anahtar proteinler3. Beklendiği gibi, Rho protein fonksiyonunun disregülasyonu metastaz, anjiyogenez ve diğerleri gibi insan patolojileri bir dizi karıştığı olmuştur. Özellikle ilgi, hücresel redoks durumu hücre göçü ve yapışma modülasyonu nda baskın bir rol oynar. Reaktif oksijen türlerindeki artışlar (ROS) gibi redoks homeostazındaki değişiklikler, bir dizi hücre tipinde ve insan hastalıklarında Rho protein aktivitesini ve adezyonu düzenleyen gösterilmiştir4,5,6 ,7,8. Örneğin, dna hasar onarım serine / threonin kizaz A-T-mutasyona uğramış bir mutasyon neden olduğu nörolojik bozukluk ataksi-telanjiektazi (A-T), muzdarip bireyler, metastatik kanser riski var9, 10. Bu hastalarda ve hücre hatlarında ATM kiazaz aktivitesinin kaybı, genetik mutasyon veya kimyasal inhibisyon yoluyla, pentoz fosfat yolunun disfonksiyonu nedeniyle oksidatif stres yüksek düzeyde sonuçları7,11, 12. Yıl. Ayrıca, laboratuvardan yapılan son çalışmalar, Rho ailesi GTPases in vitro5’inaktive edilmesinin doğrudan bir sonucu olarak sitoskeletal dinamikleri (yani yapışma ve yayılma) değiştirerek A-T’de ROS için patofizyolojik bir rolvurgulamıştır. Sonuçta, Rho aile aktivasyonu neden sitoskelet dinamikleri bu değişiklikler A-T hastalarında belirtilen metastatik kanser riskinin artmasına yol açabilir5,13. Bu nedenle, oksidatif stres sırasında hücre-matris etkileşimleri arasındaki etkileşimi anlamak yapışma ve yayılma nın düzenlenmesi hakkında öngörüler sağlayabilir. Bu çalışmalar aynı zamanda rho ailesi GTPases için bu sinyal süreçlerinde olası bir rol içine daha fazla araştırma için zemin hazırlayabilir.
Burada açıklanan adezyon montaj erken hücresel dinamikleri incelemek için bir protokol ve ATM kinaaz aktivitesiin inhibisyonu nedeniyle oksidatif stres sırasında yayılan. Bu test, ECM proteini fibronektin (FN) ankraja bağlı hücrelerin iyi karakterize mekanizmasına dayanmaktadır. Süspansiyon tutulan hücreler FN üzerine kaplanmış olduğunda, birkaç Rho GTPases aktin sitoskelet aliyi kontrol koordine3,14. Hücrelerin yuvarlak ve dairesel görünümden düzleştirilmiş ve genişlemiş olması yla morfolojik değişiklikler gözlenir. Bu gözlemler ile birlikte ECM ile çok sayıda matris yapışıklıkların geliştirilmesidir. Bu değişiklikler, hücreler yapışır ve yayıldı gibi ilk saat boyunca Rac1 ile RhoA biphasik aktivasyonu atfedilir 15,16.
Adezyon morfolojisi ve dinamiğinin yanı sıra hücre yayılımını incelemek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Ancak, bu yöntemler sofistike uzun vadeli, canlı görüntüleme toplam iç yansıma floresans (TIRF) veya konfokal mikroskopi sistemlerine dayanır. Bu nedenle, kullanıcıların özel ekipman ve yazılımerişimi olmalıdır. Ayrıca, bu biyo-görüntüleme sistemlerinin gerektirdiği kurulum süresi, özellikle birden fazla inhibitörü veya tedavi koşullarını aynı anda test ederken erken yapışma olaylarını yakalamayı zorlaştırmaktadır.
Burada ayrıntılı olarak kullanılan yöntemler, yapışma montajını yöneten ve in vitro olarak yayılan parametreleri değerlendirmek için basit, ekonomik, ancak nicel bir yol sağlar. Protokol, epifloresan mikroskobu ve CCD kamera gibi yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanları kullanılarak gerçekleştirilir. Bu titre, daha önce 5 kez gösterilmiştir ATM kiazaz aktivitesikimyasal inhibisyonu nedeniyle oksidatif stres bir süre sonra bir FN kaplı yüzeye ankraj bağımlı hücrelerin uygulanması içerir. Kaplamayı takiben, hücrelerin belirli süreler boyunca takmasına ve yapışmasına izin verilir. Eklenmemiş hücreler yıkanırken, bağlı hücreler sabitlenir ve yapışma belirteçlerine (örneğin, paxillin) ve yayılma (örneğin, F-aktin)2,5floresan bazlı antikorlarla etiketlenir. Bu proteinler daha sonra görselleştirilir ve epifloresan mikroskobu kullanılarak kaydedilir. Sonraki veri analizi serbestçe kullanılabilir Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Ayrıca, bu yöntem farklı ECM proteinleri, çeşitli oksidanlar/hücre kültürü koşulları veya çeşitli ankraja bağlı hücre hatları ile tedavi dahil olmak üzere çok çeşitli koşullar altında yapışma dinamiklerini incelemek için uyarlanabilir. biyolojik sorular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, hücre yayılımı sırasında dinamik sitoiskelet remodeling için anakağa bağlı hücre türlerini hızla taramak için çok yönlü ve ekonomik bir yoldur. Özellikle bu yöntem, hücreler FN’ye yapıştığında oksidatif stres sırasında stres lifi ve fokal yapışma oluşumunu nicel olarak inceler (Şekil 1A). Ayrıca, bu hücresel fenotipler onlar hücre eki sırasında rolleri belgelenmiş ve15,16,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar dr Scott R. Hutton ve Meghan S. Blackledge el yazması eleştirel inceleme için teşekkür ederiz. Bu çalışma High Point Üniversitesi Araştırma ve Sponsor programları (MCS) ve North Carolina State University (MCS) Biyoteknoloji Programı tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
