رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات
Summary
التفاعلات GPCR-β-arrestin هي حقل الناشئة في اكتشاف المخدرات GPCR. ومن الضروري وضع أساليب دقيقة ودقيقة وسهلة الإعداد لرصد هذه التفاعلات في النظم الحية. نعرض فحص اكمبية هيكلية لمراقبة تفاعلات GPCR-β-arrestin في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، ويمكن توسيعه إلى أي GPCR.
Abstract
التفاعلات بين مستقبلات G-البروتين المقترنة (GPCRs) وβ-arrestins هي عمليات حيوية مع الآثار الفسيولوجية ذات أهمية كبيرة. حاليا، فإن توصيف الأدوية الجديدة نحو تفاعلاتها مع β-arrestins وغيرها من البروتينات السيتوسية هو قيمة للغاية في مجال اكتشاف المخدرات GPCR لا سيما خلال دراسة الآلام المتحيزة GPCR. هنا، نعرض تطبيق تحليل استكمال الهيكلية رواية لرصد بدقة مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. هذه الطريقة بسيطة ودقيقة ويمكن أن تمتد بسهولة إلى أي GPCR ذات أهمية، وأيضا لديها ميزة أنه يتغلب على التفاعلات غير محددة بسبب وجود المروج التعبير منخفضة موجودة في كل نظام ناقلات. يوفر هذا التحليل التكامل الهيكلي السمات الرئيسية التي تسمح برصد دقيق ودقيق للتفاعلات مستقبلات بيتا-arrestin، مما يجعلها مناسبة في دراسة الآلام المتحيزة من أي نظام GPCR، فضلا عن GPCR c-terminus ‘الفسفورية رموز ‘ مكتوبة من قبل مختلف GPCR-kinases (GRKs) والتعديلات ما بعد الترجمة من arrestins التي استقرار أو زعزعة استقرار مجمع مستقبلات بيتا-arrestin.
Introduction
تمثل GPCRs الهدف من ما يقرب من 35٪ من الأدوية الحالية في السوق1،2 وفهم واضح للأدوية لها أمر بالغ الأهمية في تطوير الأدوية العلاجية الجديدة3. واحدة من الجوانب الرئيسية في اكتشاف المخدرات GPCR، لا سيما خلال تطوير الناهضات المتحيزة هو توصيف ligands جديدة نحو مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات4 وبيتا-arrestin التفاعلات مع البروتينات الربابية الأخرى مثل كما clathrin5.
وقد تم توثيق أن إشارات تعتمد على β-arrestin يلعب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية مثل اضطراب ثنائي القطب, الاكتئاب الكبير, والفصام6 وأيضا الآثار الجانبية الشديدة في بعض الأدوية مثل المورفين7.
الأساليب الحالية المستخدمة لرصد هذه التفاعلات عادة لا تمثل المستويات الذاتية الفعلية للبروتينات في الدراسة، في بعض الحالات أنها تظهر إشارة ضعيفة، وتبييض الصور واعتمادا على GPCR قد يكون من الصعب من الناحية الفنية لإعداد8. هذا الفحص التكامل الهيكلي الجديد يستخدم ناقلات المروج التعبير المنخفض من أجل تقليد المستويات الفسيولوجية الذاتية ويوفر حساسية عالية بالمقارنة مع الأساليب الحالية9. باستخدام هذا النهج، كان من الممكن بسهولة توصيف مستقبلات Galanin-β-arrestin € وأيضا β-arrestin2-clathrin التفاعلات10. ويمكن استخدام هذه المنهجية على نطاق واسع إلى أي GPCR ذات أهمية خاصة حيث β-arrestins تلعب وظيفة فسيولوجية رئيسية أو إشاراتها ذات الصلة في بعض الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام الطريقة المعروضة هنا، يمكن رصد التفاعلات بين أي GPCR وβ-arrestin1/2 في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي باستخدام هذا الفحص المكمّل الهيكلي GPCR-β-arrestin. في هذا الصدد، تمكنا من مراقبة التفاضلة β-arrestin التجنيد بين isoforms بيتا-arrestin اثنين من قبل GLP-1r (A prototypical فئة B GPCR)، لاحظنا أيضا تفكك مستقبلات بيتا-ar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج البحوث (NRF- 2015M3A9E7029172) من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
