GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速
Summary
GPCR-β-アレスチン相互作用は、GPCR創薬における新興分野である。このような生きたシステムの相互作用を監視するには、正確で正確で簡単に設定する方法が必要です。我々は、リアルタイム生細胞におけるGPCR-β-アレスチン相互作用を監視する構造補体アッセイを示し、あらゆるGPCRに拡張することができる。
Abstract
Gタンパク質結合受容体(GPCR)とβ-アレスチンとの相互作用は、非常に重要な生理学的意味を持つ重要なプロセスである。現在、β-アレスチンおよび他のサイトソールタンパク質との相互作用に対する新薬の特性評価は、特にGPCRバイアスアゴニズムの研究においてGPCR創薬の分野において非常に貴重である。ここでは、リアルタイムの生体系における受容体β-アレスチン相互作用を正確に監視する新規な構造補体アッセイの応用を示す。この方法は、単純で正確であり、目的の任意のGPCRに容易に拡張することができ、また、各ベクター系に存在する低発現プロモーターの存在による非特異的相互作用を克服するという利点を有する。この構造補体アッセイは、受容体β-アレスチン相互作用の正確かつ正確なモニタリングを可能にする重要な特徴を提供し、GPCR系の偏ったアゴニズムとGPCR c-terminus’リン酸化の研究に適しています。異なるGPCR-キナーゼ(GRK)と受容体β-アレスチン複合体を安定または不安定化させるアレチンの翻訳後修飾によって書かれたコード。
Introduction
GPPCは、市場における現在の薬剤の約35%の目標を表し、2、その薬理学の明確な理解は、新規治療薬3の開発において重要である。GPCR創薬における重要な側面の1つは、特に偏ったアゴニストの開発中に、受容体β-アレスチン相互作用4およびβ-アレチン相互作用に対する新規リガンドの特徴付けである。クラトリン5として.
β-アレスチン依存シグナル伝達は、双極性障害、大うつ病、統合失調症6などの神経障害において重要な役割を果たし、モルヒネ7などの一部の薬物においても重篤な副作用を有すると報告されている。
これらの相互作用を監視するために使用される現在の方法は、通常、研究におけるタンパク質の実際の内因性レベルを表すものではなく、場合によっては弱いシグナル、光漂白、およびGPCRに応じて8を設定することは技術的に困難である可能性があります。この新しい構造補体アッセイは、内因性の生理学的レベルを模倣するために低発現プロモーターベクターベクターを使用し、現在の方法9と比較して高い感度を提供する。このアプローチを用いて、ガラニン受容体β-アレスチン1/2およびβ-アレスチン2-クラトリン相互作用10を容易に特徴付けさせられた。この方法論は、β-アレスチンが主要な生理学的機能を果たすか、またはそのシグナル伝達がいくつかの疾患に関連する特定の関心のあるGPCRに広く使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示される方法を用いて、任意のGPCRとβ-アレストリン1/2との相互作用は、このGPCR-β-アレストリン構造補体アッセイを用いてリアルタイムの生体系で監視することができる。この点に関して、GLP-1r(原型BGPCR)による2つのβ-アレスチンアイソフォーム間の微分β-アレスチン募集を観察することができ、最大値に達してから数分後に受容体β-アレスチン複合体の解離も観察した。発光信号?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、科学・ICT・未来計画省が出資する韓国国立研究財団(NRF)の研究プログラム(NRF-2015M3A9A7029172)の助成金によって支援されました。
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
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