Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée
Summary
Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) utilise la cytométrie du débit pour détecter sensible les différences dans l’abondance des interactions protéines-protéines ciblées entre deux échantillons. QMI peut être effectué en utilisant une petite quantité de biomatériau, ne nécessite pas d’étiquettes génétiquement modifiées, et peut être adapté pour tout réseau d’interaction protéique précédemment défini.
Abstract
Les interactions dynamiques protéines-protéines contrôlent le comportement cellulaire, de la motilité à la réplication de l’ADN en passant par la transduction du signal. Cependant, il est techniquement difficile de surveiller les interactions dynamiques entre plusieurs protéines dans un réseau d’interaction protéique. Ici, nous présentons un protocole pour l’immunoprécipitation multiplexe quantitative (QMI), qui permet l’évaluation quantitative des changements de pli dans les interactions protéiques basées sur des mesures relatives de fluorescence des protéines dans les complexes partagés détectés par Exposed Épitopes de surface (PiSCES). Dans QMI, les complexes protéiques des lysates cellulaires sont immunoprécipités sur les microsphères, puis sondés avec un anticorps étiqueté pour une protéine différente afin de quantifier l’abondance du PiSCES. Les anticorps immunoprécipitations sont conjugués à différentes régions spectrales magbead, ce qui permet à un cytomètre de flux de différencier plusieurs immunoprécipitations parallèles et de quantifier simultanément la quantité d’anticorps de sonde associée à chacune. QMI n’exige pas le marquage génétique et peut être effectué en utilisant un biomatériau minimal par rapport à d’autres méthodes d’immunoprécipitation. QMI peut être adapté pour n’importe quel groupe défini de protéines en interaction, et a jusqu’à présent été utilisé pour caractériser les réseaux de signalisation dans les lymphocytes T et les synapses neuronales de glutamate. Les résultats ont mené à la nouvelle génération d’hypothèse s’est chargée d’applications diagnostiques et thérapeutiques potentielles. Ce protocole comprend des instructions pour effectuer QMI, de la sélection initiale du panneau d’anticorps jusqu’aux essais en cours d’exécution et à l’analyse des données. L’assemblage initial d’un test QMI consiste à filtrer les anticorps pour générer un panneau et à déterminer empiriquement un tampon de lyse approprié. La préparation subséquente de réactif inclut covalently accouplement des anticorps d’immunoprécipitation aux MagBeads, et anticorps de sonde de biotinylating de sorte qu’ils puissent être étiquetés par un fluorophore streptavidin-conjugué. Pour exécuter l’essai, le lysate est mélangé avec des MagBeads pendant la nuit, puis les perles sont divisées et incubées avec différents anticorps de sonde, et puis une étiquette de fluorophore, et lues par cytométrie de flux. Deux tests statistiques sont effectués pour identifier les PiSCES qui diffèrent considérablement entre les conditions expérimentales, et les résultats sont visualisés à l’aide de cartes thermiques ou de diagrammes de nœuds.
Introduction
Les interactions protéines-protéines dynamiques constituent les cascades de signalisation moléculaire et les structures motiles qui sont la base fonctionnelle de la plupart des physiologie cellulaires1. Ces processus sont souvent représentés comme des voies de signalisation linéaires qui passent d’un état stable à partir d’entrées uniques, mais les données expérimentales et de modélisation montrent clairement qu’elles fonctionnent comme des réseaux intégrés2,3, 4. Dans le cas des protéines G, différents récepteurs ont souvent la capacité d’activer la même protéine G, et un seul récepteur peut également activer plus d’un type de protéine G5,6. Pour que le nombre relativement faible de classes de protéines G module spécifiquement un vaste éventail de fonctions cellulaires telles que la transmission synaptique, la régulation hormonale et la migration cellulaire, les cellules doivent à la fois intégrer et différencier ces signaux4 , 5. Les preuves ont montré que cette spécificité de signal, pour les protéines G aussi bien que d’autres, est principalement dérivée sur la base des interactions protéine-protéine finement réglées et de leur dynamique temporelle1,3, 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7. Étant donné que les réseaux de signalisation sont composés de complexes protéiques dynamiques avec de multiples entrées, sorties et boucles de rétroaction, une seule perturbation a la possibilité de modifier l’équilibre homéostatique global de la physiologie d’une cellule4 ,7. Il est maintenant largement admis que la signalisation devrait être examinée du point de vue du réseau afin de mieux comprendre comment l’intégration de multiples entrées contrôle les fonctions cellulaires discrètes dans la santé et la maladie7,8, 9,10,11,12,13. À la lumière de cela, Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) a été développé pour recueillir à moyen débit, des données quantitatives sur les changements de pli dans les réseaux dynamiques d’interaction des protéines.
QMI est un test à base d’anticorps dans lequel le lysate cellulaire est incubé avec un panneau d’anticorps immunoprécipitation qui sont covalently couplés à des perles magnétiques contenant des rapports distincts de colorants fluorescents. Le fait d’avoir des anticorps spécifiques couplés à des classes distinctes de perles magnétiques permet une co-immunoprécipitation simultanée de protéines cibles multiples provenant du même lysate. Après l’immunoprécipitation (IP), les perles magnétiques sont incubées avec un deuxième anticorps de sonde fluorophore-conjugué (ou anticorps biotinylated en même temps que le streptavidin fluorophore-conjugué). Les co-associations entre les protéines reconnues par chaque paire d’anticorps ip anticorps-probe, ou PiSCES (protéines dans des complexes partagés détectés par des épitopes de surface exposés), sont ensuite détectées par cytométrie de débit et peuvent être comparées quantitativement entre différents conditions de l’échantillon14. Des illustrations de la figure 1 montrent les étapes de l’exécution d’un test QMI, y compris un diagramme de perles magnétiques avec des complexes protéiques immunoprécipités étiquetés par des anticorps de sonde conjugués fluorescents (figure 1C).
La sensibilité de QMI dépend de la concentration en protéines du lysate par rapport au nombre de perles magnétiques utilisées pour l’immunoprécipitation, et la réalisation d’une résolution pour détecter 10% des changements de pli ne nécessite qu’une petite quantité de matériau de départ par rapport à d’autres méthodes co-IP14,15. Par exemple, la quantité de matériel de départ utilisée dans QMI est similaire à celle requise pour un sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), mais de multiples interactions sont détectées dans un seul essai QMI. Des analyses QMI utilisant 20 IP et 20 cibles de sonde ont été effectuées à l’aide de 1-5 x 105 lymphocytes T primaires isolés d’une biopsie de la peau de 4 mm, des préparations synaptosomal P2 d’une section coronale de 3 mm du cortex préfrontal de la souris, ou 3 x 106 souris cultivées primaires neurones corticaux14,16,17. Cette sensibilité rend QMI utile pour l’analyse de cellules ou de tissus avec une disponibilité limitée, comme les échantillons cliniques.
QMI peut être adapté pour n’importe quel réseau d’interaction protéique précédemment défini (à condition que des anticorps soient disponibles), et à ce jour a été développé pour analyser le signalosome de récepteur d’antigène de cellules T (TCR) et un sous-ensemble de protéines aux synapses glutamatergiques dans les neurones 17 Annonces , 18. Dans des études sur la signalisation des récepteurs des lymphocytes T, QMI a d’abord été utilisé pour identifier les changements induits par la stimulation dans piSCES, puis pour distinguer les patients auto-immuns d’un groupe témoin, détecter la signalisation auto-immune endogène, et enfin générer un hypothèse impliquant un sous-réseau déséquilibré d’interactions associés à la maladie14. Plus récemment, le même panneau QMI a été utilisé pour déterminer que la sélection des thymocytes est déterminée par des différences quantitatives plutôt que qualitatives dans la signalisation des protéines associées au TCR19. Dans les neurones, QMI a été utilisé pour décrire la réorganisation spécifique à l’entrée d’un réseau d’interaction protéique pour des types distincts de signaux d’entrée d’une manière qui soutient les nouveaux modèles émergents de plasticité synaptique17. En outre, ce panneau QMI synaptique a été utilisé pour identifier les différences dans sept modèles murins de l’autisme, regrouper les modèles en sous-groupes en fonction de leurs biosignatures PiSCES, et émettre avec précision un déficit moléculaire partagé qui n’était pas reconnu auparavant. dans l’un des modèles16. Une approche similaire pourrait être utilisée pour dépister d’autres sous-groupes qui pourraient répondre à différents traitements médicamenteux, ou affecter des médicaments à des sous-groupes spécifiques réactifs. QMI a des applications potentielles dans le diagnostic, la sous-typage des patients, et le développement de médicaments, en plus de la science fondamentale.
Pour assembler un panneau d’anticorps QMI, les protocoles initiaux de dépistage et de sélection des anticorps sont décrits à la section 1, ci-dessous. Une fois que les panneaux d’anticorps sont identifiés, les protocoles de conjugaison des anticorps sélectionnés aux perles magnétiques pour la propriété intellectuelle, et pour la biotinylation des anticorps de la sonde sélectionnés, sont décrits à la section 2. Le protocole d’exécution de l’analyse QMI sur les lysates cellulaires ou tissulaires est décrit dans la section 3. Enfin, puisqu’une seule expérience peut générer 5 x 105 points de données individuels, des instructions et des codes informatiques pour faciliter le traitement, l’analyse et la visualisation des données sont fournis à la section 4. Un aperçu du flux de travail décrit dans les sections 2-4 est affiché à la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse QMI exige des investissements substantiels dans le développement de panneaux d’anticorps, l’équipement et les réactifs, mais une fois l’analyse établie, on peut recueillir des données de haute dimension observant les réseaux d’interaction protéique lorsqu’ils répondent à des Stimuli. Techniquement, l’Agence QMI exige un tuyautage minutieux et un suivi des emplacements des puits d’échantillons et d’anticorps. L’étiquetage minutieux des plaques d’analyse est utile, tout comme la fabrication d’un modèl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Tessa Davis pour ses contributions importantes au développement des tests de l’Agence QMI, ainsi que les membres actuels et anciens des laboratoires Smith et Schrum pour leurs conseils techniques et leur contribution intellectuelle. Ces travaux ont été financés par les subventions du NIMH R01 MH113545 et R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
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