Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada
Summary
La inmunoprecipitación por multiplex (QMI) cuantitativa utiliza citometría de flujo para la detección sensible de diferencias en la abundancia de interacciones proteínas y proteínas dirigidas entre dos muestras. QMI se puede realizar utilizando una pequeña cantidad de biomaterial, no requiere etiquetas genéticamente diseñadas y se puede adaptar para cualquier red de interacción de proteínas previamente definida.
Abstract
Las interacciones dinámicas proteínas y proteínas controlan el comportamiento celular, desde la motilidad hasta la replicación del ADN y la transducción de la señal. Sin embargo, monitorear las interacciones dinámicas entre múltiples proteínas en una red de interacción proteica es técnicamente difícil. Aquí, presentamos un protocolo para la Inmunoprecipitación Cuantitativa múltiple (QMI), que permite la evaluación cuantitativa de los cambios de pliegue en las interacciones proteicas basadas en mediciones relativas de fluorescencia de Proteínas en Complejos Compartidos detectadas por Exposed Epítopos superficiales (PiSCES). En el QMI, los complejos proteicos de los lysaatos celulares se inmunoprecipitan en las microesferas y luego sondean con un anticuerpo etiquetado para una proteína diferente con el fin de cuantificar la abundancia de PiSCES. Los anticuerpos de inmunoprecipitación se conjugan en diferentes regiones espectrales de MagBead, lo que permite que un citómetro de flujo diferencie múltiples inmunoprecipitaciones paralelas y cuantifique simultáneamente la cantidad de anticuerpo de sonda asociado con cada una. QMI no requiere etiquetado genético y se puede realizar utilizando biomaterial mínimo en comparación con otros métodos de inmunoprecipitación. QMI se puede adaptar para cualquier grupo definido de proteínas que interactúan, y hasta ahora se ha utilizado para caracterizar las redes de señalización en las células T y las sinapsis de glutamato neuronal. Los resultados han dado lugar a una nueva generación de hipótesis con posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Este protocolo incluye instrucciones para realizar QMI, desde la selección inicial del panel de anticuerpos hasta la ejecución de ensayos y el análisis de datos. El montaje inicial de un ensayo QMI implica la detección de anticuerpos para generar un panel y determinar empíricamente un búfer de lisis adecuado. La preparación posterior de reactivos incluye el acoplamiento covalente de anticuerpos de inmunoprecipitación a MagBeads, y anticuerpos de sonda biotinylantes para que puedan ser etiquetados por un fluoróforo conjugado con estreptavidina. Para ejecutar el ensayo, el islato se mezcla con MagBeads durante la noche, y luego las cuentas se dividen e incuban con diferentes anticuerpos de sonda, y luego una etiqueta de fluoróforo, y se lee por citometría de flujo. Se realizan dos pruebas estadísticas para identificar PiSCES que difieren significativamente entre las condiciones experimentales, y los resultados se visualizan mediante mapas de calor o diagramas de borde de nodo.
Introduction
Las interacciones dinámicas proteína-proteína constituyen las cascadas de señalización molecular y las estructuras móviles que son la base funcional de la mayoría de la fisiología celular1. Estos procesos a menudo se representan como vías de señalización lineal que cambian entre estados estables basados en entradas individuales, pero los datos experimentales y de modelado muestran claramente que funcionan como redes integradas2,3, 4. En el caso de las proteínas G, diferentes receptores a menudo tienen la capacidad de activar la misma proteína G, y un solo receptor también puede activar más de un tipo de proteína G5,6. Para que el número relativamente pequeño de clases de proteínas G modula específicamente una amplia gama de funciones celulares como la transmisión sináptica, la regulación hormonal y la migración celular, las células deben integrar y diferenciar estas señales4 , 5. La evidencia ha demostrado que esta especificidad de la señal, tanto para las proteínas G como para otras, se deriva principalmente sobre la base de interacciones proteína-proteína finamente afinadas y su dinámica temporal1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Debido a que las redes de señalización se componen de complejos proteicos dinámicos con múltiples entradas, salidas y bucles de retroalimentación, una sola perturbación tiene la oportunidad de alterar el equilibrio homeostático general de la fisiología4 de una célula ,7. Ahora se acuerda ampliamente que la señalización debe ser examinada desde una perspectiva de red con el fin de comprender mejor cómo la integración de múltiples entradas controla las funciones celulares discretas en la salud y la enfermedad7,8, 9,10,11,12,13. A la luz de esto, se desarrolló la Inmunoprecipitación Múltiple Cuantitativa (QMI) para recopilar datos cuantitativos de rendimiento medio sobre los cambios de pliegue en las redes dinámicas de interacción de proteínas.
QMI es un ensayo basado en anticuerpos en el que el lisato celular se incuba con un panel de anticuerpos de inmunoprecipitación que se acoplan covalentemente a cuentas magnéticas que contienen proporciones distintas de colorantes fluorescentes. Tener anticuerpos específicos acoplados a distintas clases de cuentas magnéticas permite la co-inmunoprecipitación simultánea de múltiples proteínas diana del mismo lisato. Después de la inmunoprecipitación (IP), las perlas magnéticas se incuban con un segundo anticuerpo de sonda conjugada con fluoróforo (o anticuerpo biotinilado junto con estreptavidina conjugada con fluoróforo). Las coasociaciones entre las proteínas reconocidas por cada par de anticuerpos de anticuerpos IP- sondeo, o PiSCES (proteínas en complejos compartidos detectados por epítopos de superficie expuestos), se detectan por citometría de flujo y se pueden comparar cuantitativamente entre diferentes condiciones de la muestra14. Las ilustraciones de la Figura 1 muestran los pasos necesarios para ejecutar un ensayo QMI, incluido un diagrama de cuentas magnéticas con complejos proteicos inmunoprecipitados etiquetados por anticuerpos de sonda conjugados fluorescentes (Figura1C).
La sensibilidad de QMI depende de la concentración proteica del lisado en relación con el número de perlas magnéticas utilizadas para la inmunoprecipitación, y lograr una resolución para detectar cambios de pliegue del 10% requiere sólo una pequeña cantidad de material de partida en comparación con otros métodos co-IP14,15. Por ejemplo, la cantidad de material de partida utilizado en QMI es similar a la necesaria para un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas sándwich (ELISA), pero se detectan múltiples interacciones en un solo ensayo QMI. Los ensayos QMI con 20 IP y 20 dianas de sonda se han realizado utilizando células T primarias de 1-5 x 105 aisladas de una biopsia de piel de 4 mm, preparaciones sinapscontraómicas P2 a partir de una sección coronal de 3 mm de corteza prefrontal del ratón, o 3 x 106 neuronas corticales14,16,17. Esta sensibilidad hace que QMI sea útil para el análisis de células o tejidos con disponibilidad limitada, como muestras clínicas.
QMI se puede adaptar para cualquier red de interacción proteica previamente definida (siempre que los anticuerpos estén disponibles), y hasta la fecha se ha desarrollado para analizar el señalosoma del receptor de antígeno de células T (TCR) y un subconjunto de proteínas en las sinapsis glutamatérgicas en las neuronas 17 , 18. En estudios de señalización de receptores de células T, QMI se utilizó primero para identificar los cambios inducidos por la estimulación en PiSCES, y luego para distinguir a los pacientes autoinmunes de un grupo de control, detectar la señalización autoinmune endógena, y finalmente para generar una hipótesis que implica una subred de interacciones asociada a la enfermedad desequilibrada14. Más recientemente, se utilizó el mismo panel QMI para determinar que la selección de timocitos está determinada por diferencias cuantitativas en lugar de cualitativas en la señalización proteica asociada a la TCR19. En las neuronas, QMI se utilizó para describir la reorganización específica de la entrada de una red de interacción proteica para distintos tipos de señales de entrada de una manera que apoya los nuevos modelos de plasticidad sináptica17. Además, este panel QMI sináptico se utilizó para identificar diferencias en siete modelos de ratón de autismo, agrupar los modelos en subgrupos basados en sus biofirmas PiSCES, e hipotetizar con precisión un déficit molecular compartido que antes no era reconocido en uno de los modelos16. Un enfoque similar podría utilizarse para detectar otros subgrupos que podrían responder a diferentes tratamientos farmacológicos, o asignar medicamentos a subgrupos específicos con capacidad de respuesta. QMI tiene aplicaciones potenciales en diagnóstico, sub-tipado de pacientes y desarrollo de medicamentos, además de ciencia básica.
Para ensamblar un panel de anticuerpos QMI, los protocolos iniciales de selección y cribado de anticuerpos se describen en la Sección 1, a continuación. Una vez identificados los paneles de anticuerpos, los protocolos para la conjugación de los anticuerpos seleccionados con las perlas magnéticas para IP y para la biotinylación de los anticuerpos de sonda seleccionados, se describen en la Sección 2. El protocolo para ejecutar el ensayo QMI en los líticos celulares o tisulares se describe en la Sección 3. Por último, dado que un solo experimento puede generar puntos de datos individuales de 5 x 10 5, las instrucciones y los códigos informáticos para ayudar en el procesamiento, análisis y visualización de datos se proporcionan en la Sección 4. En la Figura 1se muestra una descripción general del flujo de trabajo descrito en las secciones 2-4.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo QMI requiere una inversión sustancial en el desarrollo de paneles de anticuerpos, equipos y reactivos, pero una vez establecido el ensayo, se pueden recopilar datos de alta dimensión observando redes de interacción de proteínas a medida que responden a las Estímulos. Técnicamente, QMI requiere un cuidadoso pipeteo y seguimiento de las ubicaciones de pozos de muestras y anticuerpos. Etiquetar cuidadosamente las placas de ensayo es útil, al igual que hacer una plantilla detallada de las ubicaciones de pozo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer a Tessa Davis por sus importantes contribuciones al desarrollo del ensayo QMI, y a los miembros actuales y anteriores de los laboratorios Smith y Schrum por su orientación técnica y aportación intelectual. Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIMH R01 MH113545 y R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
References
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
