קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation
Summary
כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.
Abstract
אינטראקציות חלבון חלבונים דינאמיות שולטות בהתנהגות התאית, מתנועתיות ועד לשכפול דנ א לסימני התמרה. עם זאת, מעקב אחר אינטראקציות דינמיות בין מספר חלבונים ברשת אינטראקציה חלבון היא קשה מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור כמותיים מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI), המאפשר הערכה כמותית של שינויי מקפלים באינטראקציות חלבונים המבוססות על מדידות זריחה יחסית של חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי חשופים אפיסקופים מפני השטח (דגים). ב QMI, מכלולי חלבון מ-lysates תא הם immunoprecipitated על מיקרוספירות, ולאחר מכן נחקר עם נוגדן בתווית עבור חלבון שונה כדי לכמת את השפע של דגים. נוגדנים Immunoprecipitation מובחנות אזורים ספקטרליים שונים, אשר מאפשר cytometer זרם להבדיל immunoprecipitations מקבילים מרובים ובמקביל לכמת את כמות נוגדן בדיקה הקשורים לכל. QMI אינו דורש תיוג גנטי ניתן לבצע באמצעות ביומטריה מינימלית לעומת שיטות immunoprecipitation אחרות. QMI יכול להיות מותאם עבור כל קבוצה מוגדרת של שימוש בחלבונים, ולכן יש עד כה שימש לאפיון רשתות איתות בתאי T ו-הסינפסות העצבית גלוטמט. התוצאות הובילו ליצירת השערה חדשה עם יישומים פוטנציאליים אבחון וטיפולי. פרוטוקול זה כולל הוראות לבצע qmi, מן הבחירה הראשונית הפאנל הנוגדן דרך להפעיל בחני וניתוח נתונים. ההרכבה הראשונית של שיטת QMI כרוכה בסינון נוגדנים ליצירת פאנל, וקביעת מאגר פירוק מתאים. ההכנה הכימית הבאה כוללת מצמד מimmunoprecipitation נוגדנים לחרוזי מאגי, ונוגדנים ביולוגיים מבוססי ביוטילוטינג כך שהם יכולים להיות מסומנים על-ידי fluorophore streptavidin. כדי להפעיל את הבדיקה, ליפוסט מעורבב עם מאגחרוזים בן לילה, ולאחר מכן חרוזים מחולקים מודבטים עם נוגדנים בדיקה שונים, ולאחר מכן תווית fluorophore ולקרוא על-ידי cy, הזרמת לנסות. שני בדיקות סטטיסטיות מתבצעות כדי לזהות את הדגים שונים באופן משמעותי בין התנאים הניסיוניים, והתוצאות מתדמיינו באמצעות מפות חום או דיאגרמות קצה הצומת.
Introduction
אינטראקציות חלבונים בחלבון חלבון מהוות מבני איתות מולקולריים ומבנים מורצפת המהווים את הבסיס התפקודי של רוב הפיזיולוגיה התאית1. תהליכים אלה מתוארים לעתים קרובות כמסלולים איתות ליניארי העוברים בין מצבים יציבים המבוססים על תשומות יחיד, אבל נתונים ניסיוניים ומידול מראים בבירור שהם מתפקדים כרשתות משולבות2,3, 4. במקרה של G חלבונים, קולטנים שונים לעתים קרובות יש את היכולת להפעיל את אותו חלבון G, ו קולטן יחיד יכול גם להפעיל יותר מסוג אחד של g חלבון5,6. על מנת מספר קטן יחסית של שיעורי חלבון G לווסת במיוחד מגוון רחב של פונקציות סלולריות כגון שידור סינפטית, רגולציה הורמונלי, ואת הגירה התא, תאים חייבים להשתלב ולהבחין אותות אלה4 , 5. ראיות הראו כי האות הזה ספציפיות, עבור החלבונים של G, כמו גם אחרים, נגזר בעיקר על בסיס של אינטראקציות חלבון חלבונים מכוונים דק ודינמיקה הטמפורלית שלהם1,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. מכיוון רשתות איתות מורכבות של מכלולי חלבון דינאמי עם מספר תשומות, תפוקות, ולולאות משוב, הזדמנות בודדת יש את ההזדמנות לשנות את המאזן הכולל הומסטטי של הפיזיולוגיה של התא4 ,7. כעת מוסכם באופן נרחב כי האיתות צריך להיבדק מנקודת מבט של רשת כדי להבין טוב יותר כיצד השילוב של תשומות מרובות שולט בפונקציות הסלולר הדיסקרטית בבריאות ובמחלות7,8, . תשע,עשר,11,12,13 לאור זה, כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) פותחה כדי לאסוף תפוקה בינונית, נתונים כמותיים על שינויים לקפל ברשתות מגע דינמי של חלבון.
QMI הוא שיטת נוגדן מבוססת שבו ליפוסט התא הוא מודבטים עם פאנל של נוגדנים immunoprecipitation כי הם מצמידים מגנטי חרוזים מגנטיים המכילים יחסי צבע שונים של צבעי פלורסנט. לאחר נוגדנים ספציפיים מצמידים לכיתות שונות חרוז מגנטי מאפשר בו co-immunoprecipitation של מספר חלבונים מטרה מתוך ליפוסט זהה. לאחר immunoprecipitation (IP), חרוזים מגנטיים הם מודבטים עם שנייה, fluorophore מעלה באוב נוגדן בדיקה (או נוגדן biotinylated בשילוב עם fluorophore מצועם streptavidin). שיתוף אסוציאציות בין החלבונים המוכרים על ידי כל נוגדן IP בדיקה הצמד, או דגים (חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי אפיסקופים חשופים משטח), מזוהים אז על ידי הזרמת cy, וניתן לכמת בהשוואה בין שונות תנאים לדוגמה14. איורים באיור 1 להראות את השלבים המעורבים בהפעלת שיטת qmi, כולל דיאגרמה של חרוזים מגנטיים עם immunoprecipitated מתחמי חלבון המסומנים על ידי פלואור בדיקה בדיקת נוגדנים (איור 1ג).
הרגישות של QMI תלוי בריכוז החלבון של ליפוסט ביחס למספר חרוזים מגנטיים המשמשים לimmunoprecipitation, והשגת החלטה לזהות 10% מקפלים שינויים דורש רק כמות קטנה של חומר התחלתי לעומת אחרים שיתוף IP שיטות14,15. לדוגמה, כמות חומר ההתחלה שנעשה בו שימוש QMI דומה לזה הנדרש עבור כריך חיסוני מקושר אנזים (אליסה), אבל אינטראקציות מרובות מזוהים בתוך שיטת QMI אחת. Qmi בחני באמצעות 20 IPs ו 20 מטרות המחקר בוצעו באמצעות 1-5 x 105 הראשי T תאים מבודדים מתוך 4 ביופסיה העור, P2 synaptosomal ההכנות מ 3 מ”מ בסעיף ילתית של קליפת העכבר הקדם, או 3 x 106 העכבר הראשי העיקרי , נוירונים, מ,מאוד. רגישות זו גורמת QMI שימושי ניתוח של תאים או רקמה עם זמינות מוגבלת, כגון דגימות קליניות.
QMI יכול להיות מותאם עבור כל רשת האינטראקציה הקודמת שהוגדרו חלבון (בתנאי שנוגדנים זמינים), ועד היום פותחה כדי לנתח את קולטן האנטיגן של תא T (TCR) מערכת המשנה של חלבונים ב glutamatergic הסינפסות בנוירונים מיכל בן 17 , 18. במחקרים של האיתות קולטן תא T, qmi השתמשו לראשונה לזהות שינויים גירוי המושרה בדגים, ולאחר מכן כדי להבחין חולים אוטואימוניות מקבוצת שליטה, לזהות מאותת אוטואימוניות אנדוסוגני, ולבסוף כדי ליצור השערה מעורבים רשת משנה לא מאוזנת הקשורה למחלה של אינטראקציות14. לאחרונה, את אותו פאנל QMI שימש כדי לקבוע כי thymocyte הבחירה נקבעת על ידי כמותית ולא הבדלים איכותניים ב-TCR-המשויך חלבון איתות19. בנוירונים, QMI שימש לתאר הסדר מחדש הקלט של רשת אינטראקציה חלבון עבור סוגים שונים של אותות קלט באופן התומך מודלים חדשים המתעוררים של הפלסטיות הסינפטית17. בנוסף, זה הפאנל QMI סינפטית שימש כדי לזהות הבדלים שבעה מודלים של העכבר אוטיזם, אשכול את המודלים לקבוצות משנה על בסיס הביוחתימות שלהם דגים, ובמדויק ההשערה גרעון מולקולרי משותף כי היה בעבר לא מוכר באחד מדגמי16. גישה דומה יכולה לשמש לצורך המסך עבור קבוצות מסחר אחרות שעלולות להגיב לטיפולי סמים שונים, או להקצות תרופות לקבוצות מסוימות המגיבים לתגובה. QMI יש יישומים פוטנציאליים באבחון, משנה הקלדה החולה, פיתוח סמים, בנוסף למדע בסיסי.
כדי להרכיב פאנל נוגדן QMI, הקרנת נוגדנים ראשונית ופרוטוקולי בחירה מתוארים בסעיף 1, להלן. לאחר לוחות נוגדנים מזוהים, פרוטוקולים עבור בניינים של נוגדנים שנבחרו לחרוזים מגנטיים עבור IP, ו עבור biotinylation של נוגדנים בדיקה שנבחרו, מתוארים בסעיף 2. הפרוטוקול להפעלת הערך QMI בתאים או ברקמות מתואר בסעיף 3. לבסוף, מאחר שניסוי בודד יכול להפיק ~ 5 x 105 נקודות נתונים בודדות, הוראות וקודי מחשב כדי לסייע בעיבוד נתונים, ניתוח והדמיה מסופקים בסעיף 4. מבט כולל על זרימת העבודה המתוארת בסעיפים 2-4 מוצג באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
השקאת QMI דורש השקעה ניכרת בפיתוח פאנל הנוגדן, ציוד ריאגנטים, אבל ברגע שהנתון נקבע, ניתן לאסוף נתונים בעלי ממדים גבוהים התבוננות ברשתות אינטראקציה חלבון כפי שהם מגיבים ניסויים בשליטת גירויים. מבחינה טכנית, QMI דורש ליטוף זהיר ומעקב של דגימת ומיקומים היטב נוגדן. תיוג בזהירות של לוחיות הנתונים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר את טסה דיוויס לתרומות חשובות לפיתוח שיטת QMI, וחברים נוכחיים ולשעבר של מעבדות סמית ‘ ו-Schrum להדרכה טכנית ולקלט אינטלקטואלי. עבודה זו ממומנת על ידי NIMH מענקים R01 MH113545 ו R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
References
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
