Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation
Summary
Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) verwendet Durchflusszytometrie zum empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit gezielter Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proben. QMI kann mit einer kleinen Menge an Biomaterial durchgeführt werden, erfordert keine gentechnisch veränderten Tags und kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden.
Abstract
Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen steuern das zelluläre Verhalten, von der Beweglichkeit über die DNA-Replikation bis hin zur Signaltransduktion. Die Überwachung dynamischer Wechselwirkungen zwischen mehreren Proteinen in einem Protein-Interaktionsnetzwerk ist jedoch technisch schwierig. Hier stellen wir ein Protokoll für quantitative Multiplex-Immunpräzipitation (QMI) vor, das eine quantitative Bewertung von Faltenveränderungen in Protein-Wechselwirkungen auf der Grundlage relativer Fluoreszenzmessungen von Proteinen in Shared Complexes ermöglicht, die von Exposed Oberflächenepitope (PiSCES). In QMI werden Proteinkomplexe aus Zelllysaten auf Mikrosphären immunpräzipiert und dann mit einem markierten Antikörper für ein anderes Protein untersucht, um die Fülle von PiSCES zu quantifizieren. Immunpräzipitationsantikörper werden mit verschiedenen MagBead-Spektralregionen konjugiert, was es einem Durchflusszytometer ermöglicht, mehrere parallele Immunpräzipitationen zu unterscheiden und gleichzeitig die Menge der mit jedem zugeordneten Sondenantikörper zu quantifizieren. QMI erfordert keine genetische Kennzeichnung und kann mit minimalem Biomaterial im Vergleich zu anderen Immunpräzipitationsmethoden durchgeführt werden. QMI kann für jede definierte Gruppe von interagierenden Proteinen angepasst werden und wurde bisher verwendet, um Signalnetzwerke in T-Zellen und neuronalen Glutamatsynapsen zu charakterisieren. Die Ergebnisse haben zu einer neuen Hypothesengenerierung mit potenziellen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen geführt. Dieses Protokoll enthält Anweisungen zur Durchführung von QMI, von der ersten Auswahl des Antikörper-Panels bis hin zum Ausführen von Assays und der Analyse von Daten. Die erste Montage eines QMI-Assays umfasst das Screening von Antikörpern zur Erzeugung eines Panels und empirisch die Bestimmung eines geeigneten Lysepuffers. Die anschließende Reagenzpräparation umfasst kovalente Kopplung von Immunpräzipitationsantikörpern an MagBeads und Biotinylatations-Sondenantikörpern, so dass sie durch ein streptavidinkonjugiertes Fluorophor gekennzeichnet werden können. Um den Test durchzuführen, wird Lysat über Nacht mit MagBeads gemischt, und dann werden Perlen geteilt und mit verschiedenen Sondenantikörpern und dann einem Fluorophor-Etikett und durch Durchflusszytometrie gelesen. Zwei statistische Tests werden durchgeführt, um PiSCES zu identifizieren, die sich zwischen den versuchslichen Bedingungen erheblich unterscheiden, und die Ergebnisse werden mithilfe von Heatmaps oder Knotenkantendiagrammen visualisiert.
Introduction
Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden die molekularen Signalkaskaden und motilen Strukturen, die die funktionelle Basis der meisten zellulärenPhysiologie1 sind. Diese Prozesse werden oft als lineare Signalwege dargestellt, die zwischen stationären Zuständen auf der Grundlage einzelner Eingänge wechseln, aber experimentelle und modellierungsdaten zeigen deutlich, dass sie als integrierte Netzwerke funktionieren2,3, 4. Im Falle von G-Proteinen haben verschiedene Rezeptoren oft die Fähigkeit, das gleiche G-Protein zu aktivieren, und ein einzelner Rezeptor kann auch mehr als einen Typ von G-Protein5,6aktivieren. Damit die relativ kleine Anzahl von G-Proteinklassen gezielt eine Vielzahl zellulärer Funktionen wie synaptische Übertragung, Hormonregulation und Zellmigration modulieren kann, müssen die Zellen diese Signale integrieren und differenzieren4 , 5. Es hat sich gezeigt, dass diese Signalspezifität sowohl für G-Proteine als auch für andere in erster Linie auf der Grundlage fein abgestimmter Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihrer zeitlichen Dynamik abgeleitet wird1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Da Signalnetze aus dynamischen Proteinkomplexen mit mehreren Ein-, Ausgängen und Rückkopplungsschleifen bestehen, hat eine einzige Störung die Möglichkeit, das gesamte panostatische Gleichgewicht der Physiologie einer Zelle zu verändern4 ,7. Es besteht inzwischen weitgehend Einigkeit darüber, dass die Signalisierung aus netzwerkischer Sicht untersucht werden sollte, um besser zu verstehen, wie die Integration mehrerer Eingänge diskrete zelluläre Funktionen in Gesundheit und Krankheit steuert7,8, 9,10,11,12,13. Vor diesem Hintergrund wurde quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) entwickelt, um quantitative Daten über Faltenänderungen in dynamischen Proteininteraktionsnetzwerken zu sammeln.
QMI ist ein Antikörper-basierter Assay, bei dem Zelllysat mit einem Panel von Immunpräzipitationsantikörpern inkubiert wird, die kovalent mit magnetischen Perlen gekoppelt sind, die unterschiedliche Verhältnisse von fluoreszierenden Farbstoffen enthalten. Mit spezifischen Antikörpern gekoppelt, um verschiedene magnetische Perlenklassen ermöglicht die gleichzeitige Co-Immunpräzipitation mehrerer Zielproteine aus dem gleichen Lysat. Nach der Immunpräzipitation (IP) werden magnetische Perlen mit einem zweiten, fluorophorkonjugierten Sondenantikörper (oder biotinytem Antikörper in Verbindung mit fluorophorkonjugiertem Streptavidin) inkubiert. Die Koverbindungen zwischen den Proteinen, die von jedem IP-Antikörper-Sonden-Antikörperpaar oder PiSCES (Proteine in gemeinsamen Komplexen, die von exponierten Oberflächenepitopen nachgewiesen werden), werden dann durch Durchflusszytometrie nachgewiesen und können quantitativ zwischen verschiedenen Probenbedingungen14. Abbildungen in Abbildung 1 zeigen die Schritte, die bei der Durchführung eines QMI-Tests erforderlich sind, einschließlich eines Diagramms von magnetischen Perlen mit immunpräzipierten Proteinkomplexen, die durch fluoreszierend konjugierte Sondenantikörper gekennzeichnet sind (Abbildung 1C).
Die Sensitivität von QMI hängt von der Proteinkonzentration des Lysats im Verhältnis zur Anzahl der magnetischen Perlen ab, die für Immunpräzipitation verwendet werden, und die Erreichung einer Auflösung zum Nachweis von 10% Faltenänderungen erfordert im Vergleich zu anderen Co-IP-Methoden14,15. Beispielsweise ist die Menge des in QMI verwendeten Ausgangsmaterials ähnlich wie die Menge, die für einen Sandwich-Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) erforderlich ist, aber mehrere Wechselwirkungen werden in einem einzigen QMI-Test nachgewiesen. QMI-Assays mit 20 IPs und 20 Sondenzielen wurden mit 1-5 x 105 primären T-Zellen durchgeführt, die aus einer 4 mm Hautbiopsie isoliert wurden, P2-Synaptosomalpräparaten aus einem 3 mm koronalen Abschnitt des präfrontalen Kortex der Maus oder 3 x 106 kultivierte Mausprimär- kortikale Neuronen14,16,17. Diese Empfindlichkeit macht QMI nützlich für die Analyse von Zellen oder Geweben mit begrenzter Verfügbarkeit, wie z. B. klinische Proben.
QMI kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden (vorausgesetzt, dass Antikörper verfügbar sind), und wurde bisher entwickelt, um das T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Signalososom und eine Teilmenge von Proteinen an glutamatergen Synapsen in Neuronen zu analysieren. 17 , 18. In Studien zur T-Zell-Rezeptor-Signalisierung wurde QMI zunächst verwendet, um stimulationsinduzierte Veränderungen in PiSCES zu identifizieren und dann Autoimmunpatienten von einer Kontrollgruppe zu unterscheiden, endogene Autoimmunsignale zu erkennen und schließlich eine Hypothese mit einem unausgewogenen krankheitsassoziierten Subnetz von Wechselwirkungen14. In jüngerer Zeit wurde das gleiche QMI-Panel verwendet, um zu bestimmen, dass die Thymoseexzesse durch quantitative und nicht durch qualitative Unterschiede in der TCR-assoziierten Proteinsignalisierung19bestimmt wird. In Neuronen wurde QMI verwendet, um die eingangsspezifische Neuanordnung eines Protein-Interaktionsnetzwerks für verschiedene Arten von Eingangssignalen in einer Weise zu beschreiben, die neu entstehende Modelle der synaptischen Plastizitätunterstützt 17. Zusätzlich wurde dieses synaptische QMI-Panel verwendet, um Unterschiede in sieben Mausmodellen von Autismus zu identifizieren, die Modelle auf Basis ihrer PiSCES-Biosignaturen in Untergruppen zu bündeln und genau ein gemeinsames molekulares Defizit zu vermuten, das zuvor nicht erkannt wurde. in einem der Modelle16. Ein ähnlicher Ansatz könnte verwendet werden, um andere Untergruppen zu überprüfen, die auf verschiedene medikamentöse Behandlungen reagieren könnten, oder Medikamente bestimmten reaktionsfähigen Untergruppen zuzuweisen. QMI hat neben der Grundlagenforschung auch mögliche Anwendungen in der Diagnostik, der Patienten-Subtypisierung und der Arzneimittelentwicklung.
Um ein QMI-Antikörperpanel zusammenzustellen, werden die ersten Antikörper-Screening- und Selektionsprotokolle in Abschnitt 1 unten beschrieben. Sobald Antikörper-Panels identifiziert sind, werden in Abschnitt 2 Protokolle für die Konjugation der ausgewählten Antikörper zu magnetischen Perlen für IP und zur Biotinylierung der ausgewählten Sondenantikörper beschrieben. Das Protokoll zum Ausführen des QMI-Assays auf Zell- oder Gewebelysaten wird in Abschnitt 3 beschrieben. Da ein einzelnes Experiment 5 x 105 einzelne Datenpunkte generieren kann, werden Anweisungen und Computercodes zur Unterstützung der Datenverarbeitung, -analyse und -visualisierung in Abschnitt 4 bereitgestellt. Eine Übersicht über den in den Abschnitten 2-4 beschriebenen Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der QMI-Test erfordert erhebliche Investitionen in die Entwicklung von Antikörperplatten, Ausrüstungen und Reagenzien, aber sobald der Assay etabliert ist, kann man hochdimensionale Daten sammeln, die Protein-Interaktionsnetzwerke beobachten, während sie auf experimentell kontrollierte Reize. Technisch gesehen erfordert QMI eine sorgfältige Pipettierung und Verfolgung von Proben- und Antikörperbrunnenstandorten. Die sorgfältige Beschriftung der Assay-Platten ist nützlich, ebenso wie eine detaillierte Vorlage von B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Tessa Davis für wichtige Beiträge zur ENTWICKLUNG von QMI-Assay und aktuelle und ehemalige Mitglieder der Smith- und Schrum-Labore für technische Beratung und intellektuellen Input würdigen. Diese Arbeit wurde durch NIMH-Zuschüsse R01 MH113545 und R00 MH 102244 finanziert.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
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