جهاز الأمعاء/الكبد الدقيق فيزيولوجيا لتقييم الأدوية الدوائية والسمية
Summary
لقد كشفنا نظام microphysiological (MPS) مع الأمعاء والكبد organoids لاسيتامينوفين (APAP). توضح هذه المقالة طرق الإنتاج العضوي وتقييمات الملكية الدوائية والسمية APAP في MPS. كما يصف تحليل وظائف الأنسجة اللازمة للتحقق من صحة النتائج.
Abstract
ومن المتوقع أن يكون أداء النظم الدقيقة الفيزيولوجية التي أدخلت مؤخراً التي تزرع العضيات البشرية أفضل من أداء الحيوانات في مرحلة الاختبارات قبل الفحصي لعملية تطوير المخدرات لأنها بشرية وراثياً وتختبأ التفاعل بين الأنسجة. في هذه الدراسة، تم دمج حاجز الأمعاء البشرية (التي تحاكيها ثقافة شارك في زراعة الخلايا كاكو-2 وHT-29) والكبد المكافئ (التي تحاكيها spheroids مصنوعة من خلايا هيباتج متمايزة وخلايا نجمية الكبدية البشرية) في جهاز microfluidic لرقاقة جهازين (2-OC) لتقييم بعض الأسيتامينوفين (APAP) الدوائية (PK) والخصائص السامة. وكان MPS ثلاث جمعيات: الأمعاء فقط 2-OC، الكبد فقط 2-OC، والأمعاء / الكبد 2-OC مع نفس وسائل الإعلام تضخ كلا organoids. بالنسبة لتقييمات PK، قمنا بسد APAP في وسائل الإعلام في نقاط زمنية محددة مسبقاً بعد إدارتها إما فوق الحاجز المعوي (محاكاة الطريق الفموي) أو في وسائل الإعلام (محاكاة الطريق الوريدي)، عند 12 ميكرومتر و2 ميكرومتر على التوالي. تم تحليل عينات الوسائط من خلال عكس مرحلة اللونية السائلة عالية الضغط (HPLC). تم تحليل العضيات من أجل التعبير الجيني، وقيم TEER، للتعبير عن البروتين والنشاط، ثم تم جمعها، وإصلاحها، وتقديمها إلى مجموعة من التقييمات المورفولوجية. كان أداء تقنية MTT جيدًا في تقييم الجدوى العضوية ، ولكن التحليلات عالية المحتوى (HCA) تمكنت من اكتشاف أحداث سامة مبكرة جدًا استجابة لعلاج APAP. لقد تحققنا من أن تدفق الوسائط لا يؤثر بشكل كبير على امتصاص APAP في حين أنه يحسن بشكل كبير وظائف الكبد المكافئة. ويمكن محاكاة امتصاص الأمعاء البشرية APAP والتمثيل الغذائي الكبدي في MPS. إن الارتباط بين بيانات MPS وفي نمّجة السيليكو لديه إمكانات كبيرة لتحسين قابلية التنبؤ بالأساليب المختبرية وتوفير دقة أفضل من النماذج الحيوانية في الدراسات الدوائية السمية.
Introduction
ونظراً للاختلافات الجينية والبروتيومية، فإن النماذج الحيوانية لها قيمة تنبؤية محدودة بالنسبة لعدة نتائج بشرية. وعلاوة على ذلك، فهي تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة ومشكوك فيها أخلاقيا1. MPS هي تقنية جديدة نسبيا تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل السريرية. فهي الأجهزة microfluidic زراعة organoids (المحاكاة الاصطناعية وحدات وظيفية من الأجهزة) في ظل تدفق وسائل الإعلام التي تعزز الاتصالات organoid organoid. Organoids مصنوعة من الخلايا البشرية زيادة صلة الترجمة2،3،4. ومن المتوقع أن MPS لأداء أفضل من الاختبارات الحيوانية لأنها بشرية وراثيا وتكخيص التفاعل بين الأنسجة. عندما تعمل بكامل طاقتها، فإن MPS تقديم نتائج أكثر وضوحا، في سرعة أعلى وأقل التكاليف والمخاطر4. العديد من المجموعات النامية MPS لعدة أغراض, وخاصة نماذج المرض لاختبار فعالية المخدرات.
مستوى التعرض هو واحد من أهم المعلمات لتقييم فعالية الدواء وسميته5،6،7،8،9،10،11،12. MPS يسمح التكامل العضوي الذي يحاكي التعرض النظامي ومن المتوقع أن يكون أداؤه أفضل من ثقافة الأنسجة البشرية التقليدية 2D. هذه التكنولوجيا يمكن أن تحسن بشكل كبير التنبؤ بالمجمع امتصاص الأمعاء والكبد الأيض4.
و MPS دمج نموذج معادل الإنسان من الأمعاء والكبد هو نقطة انطلاق جيدة، معتبرا الدور المركزي لهذين الجهازين في التوافر البيولوجي للأدوية والتعرض الجهازي13,14,15. APAP هو دواء جذاب لدراسة MPS دون مكافئ الكلى لأن استقلابه يتم بشكل رئيسي من قبل الكبد16,17.
و2-OC هو جهاز microfluidic من غرفتين مناسبة لثقافة اثنين من الأنسجة البشرية المختلفة المكافئة / organoids مترابطة بواسطة microchannels16. من أجل محاكاة في المختبر البشري عن طريق الفم / الحقن الوريدي من المخدرات وتقييم آثار عبر الحديث بين الأمعاء والكبد مكافئات على المستحضرات الدوائية APAP، إلى جانب وظيفة organoids ومقومات البقاء، تم تنفيذ ثلاثة جمعيات MPS مختلفة: (1) “الأمعاء 2-OC MPS” تتألف من الأمعاء مكافئ يستند في إدراج ثقافة تحتوي على Caco-2 + HT-29 الخلايا coculture، دمجها في الجهاز 2-OC. (2) “الكبد 2-OC MPS” تتألف من spheroids الكبد مصنوعة من HepaRG + HHSteC (خلايا هيبيت الكبدية الإنسان) متكاملة في الجهاز 2-OC؛ و (3) “الأمعاء / الكبد 2-OC MPS” تتألف من ما يعادل الأمعاء في مقصورة جهاز واحد التواصل مع مكافئ الكبد في الآخر من خلال تدفق وسائل الإعلام من خلال القنوات microfluidic.
تم إجراء جميع المقايسات تحت ثابت (لا تدفق) وديناميكية (مع تدفق) الشروط بسبب تأثير المحفزات الميكانيكية (ضغط، وتمتد، والتشيد) على الخلية قابلية البقاء والوظائف18،19،20. هذه المادة يصف بروتوكول لAP البصرية عن طريق الفم / الحقن وتقليد الإدارة والامتصاص / الأيض والتحليلات السمية في 2 – OC MPS التي تحتوي على الأمعاء البشرية والكبد ما يعادل نماذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن التقييم الدقيق والموثوق للخصائص الدوائية للأدوية الجديدة التحقيقية أمر بالغ الأهمية للحد من المخاطر في خطوات التطوير التالية. MPS هي تقنية جديدة نسبيا ، التي تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل الإكلينيكية. وتتقدم مجموعتنا في تقييم الخصا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور كريستي غوجين- غيلوزو، والدكتور فيليب جريبون في الوحدة 522 INSERM، والدكتور كريستيان تريبو في الوحدة 271 INSERM لاستخدام المواد البيولوجية (خلايا هيبا RG) وإتاحتها لنا من أجل إجراء البحث الأكاديمي.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
References
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
- Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 – Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 – Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 – In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
- OECD. OECD TG 439 – In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
