Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling
Summary
We stelden een microfysiologisch systeem (MPS) met darm- en leverorganoïden bloot aan paracetamol (APAP). Dit artikel beschrijft de methoden voor organoïde productie en APAP farmacokinetische en toxicologische eigendomsbeoordelingen in de MPS. Het beschrijft ook de weefselfunctionaliteitsanalyses die nodig zijn om de resultaten te valideren.
Abstract
De onlangs geïntroduceerde microfysiologische systemen (MPS) cultiveren menselijke organoïden zullen naar verwachting beter presteren dan dieren in de preklinische tests fase van het geneesmiddel ontwikkelen proces, omdat ze genetisch menselijk en recapituleren het samenspel tussen weefsels. In deze studie werden de menselijke darmbarrière (geëmuleerd door een co-cultuur van Caco-2- en HT-29-cellen) en het leverequivalent (geëmuleerd door sferoïden gemaakt van gedifferentieerde HepaRG-cellen en menselijke lever stellatische cellen) geïntegreerd in een twee-orgaanchip (2-OC) microfluïde apparaat om wat paracetamol (APAP) farmacokinetische (PK) en toxische eigenschappen te beoordelen. De MPS had drie samenstellingen: Darm slechts 2-OC, Lever slechts 2-OC, en Darm/Lever 2-OC met de zelfde media die beide organoïden doordringen. Voor PK-beoordelingen hebben we de APAP in de media gesedisd op vooraf ingestelde tijdpunten na toediening over de darmbarrière (het emuleren van de orale route) of in de media (het emuleren van de intraveneuze route), op respectievelijk 12 μM en 2 μM. De mediamonsters werden geanalyseerd door reversed-phase hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC). Organoïden werden geanalyseerd voor genexpressie, voor TEER-waarden, voor eiwitexpressie en -activiteit, en vervolgens verzameld, vastgesteld en onderworpen aan een reeks morfologische evaluaties. De MTT-techniek presteerde goed bij het beoordelen van de levensvatbaarheid van de organoïden, maar de hoge gehalteanalyses (HCA) konden zeer vroege toxische voorvallen detecteren in reactie op apap-behandeling. We hebben geverifieerd dat de mediastroom de APAP-absorptie niet significant beïnvloedt, terwijl de leverequivalente functionaliteit aanzienlijk verbetert. De APAP menselijke darmabsorptie en leverstofwisseling kan worden geëmuleerd in de MPS. Het verband tussen MPS-gegevens en in silico-modellering heeft een groot potentieel om de voorspelbaarheid van de in vitro-methoden te verbeteren en een betere nauwkeurigheid te bieden dan diermodellen in farmacokinetische en toxicologische studies.
Introduction
Als gevolg van genomische en proteomische verschillen, dier modellen hebben beperkte voorspellende waarde voor verschillende menselijke resultaten. Bovendien zijn ze tijdrovend, duur en ethisch twijfelachtig1. MPS is een relatief nieuwe technologie die gericht is op het verbeteren van de voorspellende kracht en het verminderen van de kosten en tijd besteed aan pre-klinische tests. Het zijn microfluidische apparaten die organoïden (kunstmatige mimetiek functionele eenheden van organen) cultiveren onder mediastroom die organoïde-organoïde communicatie bevordert. Organoïden gemaakt van menselijke cellen verhogen de relevantie van de vertaling2,3,4. MPS zal naar verwachting beter presteren dan de dierproeven omdat ze genetisch menselijk zijn en het samenspel tussen weefsels samenvatten. Wanneer het volledig functioneel is, zal de MPS zinvollere resultaten opleveren, met hogere snelheid en lagere kosten en risico’s4. Veel groepen ontwikkelen MPS voor verschillende doeleinden, met name ziektemodellen om de werkzaamheid van geneesmiddelen te testen.
Blootstellingsniveau is een van de meest kritieke parameters voor de evaluatie van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen5,6,7,8,9,10,11,12. MPS maakt organoïde integratie die systemische blootstelling emuleert en zal naar verwachting beter presteren dan de traditionele 2D menselijke weefsel cultuur. Deze technologie kan de voorspelling van samengestelde darmabsorptie en levermetabolisme4aanzienlijk verbeteren.
Een MPS integratie van menselijk gelijkwaardig model van darm en lever is een goed uitgangspunt, gezien de centrale rol van deze twee organen in de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen en systemische blootstelling13,14,15. APAP is een aantrekkelijk medicijn voor het bestuderen van een MPS zonder nierequivalent omdat de metabolisatie voornamelijk wordt gedaan door de lever16,17.
De 2-OC is een tweekamermicrofluïdisch apparaat dat geschikt is voor de cultuur van twee verschillende menselijke equivalente weefsels/organoïden met elkaar verbonden door microkanalen16. Om een in vitro human orale/intraveneuze toediening van een geneesmiddel na te bootsen en de effecten van de kruisspraak tussen de darm- en leverequivalenten op APAP-farmacokinetiek te beoordelen, naast de organoïden functionaliteit en levensvatbaarheid, drie verschillende MPS assemblages werden uitgevoerd: (1) een “Darm 2-OC MPS” bestaat uit een darm equivalent gebaseerd op een cultuur insert met een Caco-2 + HT-29 cellen cocultuur, geïntegreerd in de 2-OC apparaat; (2) een “Liver 2-OC MPS” bestaande uit leversferoïden van HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) geïntegreerd in het 2-OC apparaat; en (3) een “Darm/Lever 2-OC MPS” bestaande uit het darmequivalent in het ene apparaatcompartiment dat communiceert met het leverequivalent in het andere door de mediastroom door de microfluïde kanalen.
Alle tests werden uitgevoerd onder statische (geen stroom) en dynamische (met stroom) omstandigheden als gevolg van de impact van de mechanische stimuli (compressie, stretching, en schuintrekken) op de levensvatbaarheid van de cel en functionaliteiten18,19,20. Het onderhavige artikel beschrijft het protocol voor APAP orale/intraveneuze toedieningsmultiulatie en de respectievelijke absorptie/stofwisseling en toxicologische analyses in de 2-OC MPS met menselijke darm- en leverequivalentenmodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van de farmacologische eigenschappen van onderzoekende nieuwe geneesmiddelen is van cruciaal belang voor het verminderen van het risico in de volgende ontwikkelingsstappen. De MPS is een relatief nieuwe technologie, die gericht is op het verbeteren van de voorspellende kracht en het verminderen van de kosten en tijd besteed aan preklinische tests. Onze groep is op weg in de beoordeling van farmacokinetische en toxicologische eigenschappen meestal nodig voor lood optimalisatie. We…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon bij Unit 522 INSERM en dr. Christian Trepo bij Unit 271 INSERM voor het gebruik van het biologisch materiaal (Hepa RG cellen) en voor het beschikbaar stellen van vervolgens voor ons om het academisch onderzoek uit te voeren.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
References
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
- Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 – Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 – Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 – In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
- OECD. OECD TG 439 – In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
