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Chemistry

Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.

Abstract

Espera-se que os sistemas microfisiológicos (MPS) recém-introduzidos que cultivam organoides humanos tenham um desempenho melhor do que os animais na fase de testes pré-clínicos do processo de desenvolvimento de medicamentos porque são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Neste estudo, a barreira intestinal humana (emulada por uma co-cultura de células Caco-2 e HT-29) e o equivalente hepático (emulado por esferoides feitos de células hepaRG diferenciadas e células estelares hepáticas humanas) foram integrados em um dispositivo microfluido de dois órgãos (2-OC) para avaliar algumas propriedades farmacocinóficas (APAP) e toxicológicas. O MPS tinha três conjuntos: Intestino apenas 2-OC, Fígado apenas 2-OC, e Intestino/Fígado 2-OC com a mesma mídia perfusando ambos organoides. Para avaliações de PK, dosamos o APAP na mídia em momentos de predefinição após a administração sobre a barreira intestinal (emulando a rota oral) ou na mídia (emulando a rota intravenosa), a 12 μM e 2 μM, respectivamente. As amostras de mídia foram analisadas por cromatografia líquida de alta pressão de fase invertida (HPLC). Os organoides foram analisados para expressão genética, para valores de TEER, para expressão e atividade proteica, e depois coletados, fixos e submetidos a um conjunto de avaliações morfológicas. A técnica MTT teve um bom desempenho na avaliação da viabilidade organoide, mas as análises de alto teor (HCA) foram capazes de detectar eventos tóxicos muito precoces em resposta ao tratamento apap. Verificamos que o fluxo de mídia não afeta significativamente a absorção de APAP, enquanto melhora significativamente a funcionalidade equivalente hepática. A absorção intestinal humana apap e o metabolismo hepático poderiam ser emulados no MPS. A associação entre os dados do MPS e na modelagem de sílico tem grande potencial para melhorar a previsibilidade dos métodos in vitro e proporcionar melhor precisão do que os modelos animais em estudos farmacocinéticos e toxicológicos.

Introduction

Devido a diferenças genômicas e proteômicas, os modelos animais têm valor preditivo limitado para vários desfechos humanos. Além disso, são demorados, caros e eticamente questionáveis1. O MPS é uma tecnologia relativamente nova que visa melhorar a potência preditiva e reduzir os custos e o tempo gasto com testes pré-clínicos. São dispositivos microfluidos que cultivam organoides (unidades funcionais de mimética artificial de órgãos) sob fluxo de mídia que promove a comunicação organóide-organóide. Organoides feitos de células humanas aumentam a relevância translacional2,3,4. Espera-se que o MPS se comtrate melhor do que os testes em animais porque eles são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Quando totalmente funcional, o MPS fornecerá resultados mais significativos, em maior velocidade e menores custos e riscos4. Muitos grupos estão desenvolvendo MPS para vários propósitos, especialmente modelos de doenças para testar a eficácia da droga.

O nível de exposição é um dos parâmetros mais críticos para avaliar a eficácia e toxicidade da droga5,6,7,8,9,10,11,12. O MPS permite a integração organoide que emula exposição sistêmica e espera-se que seja melhor do que a cultura tradicional do tecido humano 2D. Esta tecnologia pode melhorar significativamente a previsão de absorção intestinal composta e metabolismo hepático4.

Um MPS integrando modelo equivalente humano de intestino e fígado é um bom ponto de partida, considerando o papel central desses dois órgãos na biodisponibilidade de medicamentos e exposição sistêmica13,14,15. APAP é uma droga atraente para estudar um MPS sem um equivalente renal porque sua metabolização é feita principalmente pelo fígado16,17.

O 2-OC é um dispositivo microfluido de duas câmaras adequado para a cultura de dois diferentes tecidos/organoides equivalentes humanos interligados por microcanais16. A fim de emular uma administração oral/intravenosa humana in vitro de uma droga e avaliar os efeitos da conversa cruzada entre o intestino e os equivalentes hepáticos na farmacocinética APAP, além da funcionalidade e viabilidade dos organoides, foram realizados três diferentes conjuntos de MPS: (1) um "Intestino 2-OC MPS" composto por um equivalente intestinal baseado em uma inserção cultural contendo uma cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada ao dispositivo 2-OC; (2) um "Liver 2-OC MPS" composto por esferoides hepáticos feitos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados no dispositivo 2-OC; e (3) um "Intestino/Fígado 2-OC MPS" composto pelo equivalente do intestino em um compartimento de dispositivo comunicando-se com o equivalente hepático no outro pelo fluxo de mídia através dos canais microfluidos.

Todos os ensaios foram realizados sob condições estáticas (sem fluxo) e dinâmicas (com fluxo) devido ao impacto dos estímulos mecânicos (compressão, alongamento e cisalhamento) na viabilidade e funcionalidades da célula18,19,20. O presente artigo descreve o protocolo para emulação de administração oral/intravenosa da APAP e as respectivas análises de absorção/metabolismo e toxicológicas no MPS 2-OC contendo modelos equivalentes de intestino humano e fígado.

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Protocol

1. Produção de equivalentes teciduais para cultivo no 2-OC

  1. Produção equivalente de barreira intestinal pequena
    1. Manter as células Caco-2 e HT-29 utilizando o meio equivalente intestinal: DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% penicilina e estreptomicina, e 1% aminoácidos não essenciais, que é nomeado como "DMEM S" neste manuscrito.
    2. Retire o meio, lave duas vezes com 1x DPBS e adicione 8 mL de 0,25% Trypsin/EDTA para dissociar células Caco-2 cultivadas em frascos de cultura celular (175 cm2). Incubar por 5 min a 37 °C e parar a reação adicionando pelo menos o volume duplo do inibidor de trippsina. Realize o mesmo procedimento para células HT-29, ajustando os volumes de reagentes, uma vez que uma quantidade menor dessas células é necessária e elas são mantidas em frascos menores (75 cm2).
    3. Centrífuga a 250 x g por 5 min, remova o sobrenante de ambos os tubos e resuspenda as pelotas de células em 10 mL de células DMEM S. Count, assegurando uma viabilidade celular superior a 80%. Asepticamente integram as inserções da cultura celular em uma placa de 24 poços previamente preenchida com 400 μL de DMEM S por poço no lado basolateral (que representa a corrente sanguínea humana).
    4. Co-cultivar células Caco-2 e HT-29 a uma proporção de 9:121. Use 2,25 x 105 Caco-2 e 2,5 x 104 células HT-29 em cada intestino equivalente em um volume final de 200 μL de DMEM S. Ajuste os números e volumes celulares de acordo com o número desejado de organoides. Misture com cuidado.
    5. Pipeta 200 μL de solução celular no lado apical de cada inserção (que representa o lado do lúmen intestinal humano), semeando 250.000 células por inserção. Co-cultivar as células nas pastilhas por três semanas22. Troque o meio pelo menos três vezes por semana, aspirando-o tanto dos lados apical quanto basolateral com uma pipeta Pasteur estéril, tomando cuidado para não danificar a barreira celular intacta.
      NOTA: Proceda com a aspiração no lado apical, de modo a não tocar na barreira celular (aspirar apoiando a pipeta Pasteur na borda plástica da pastilha da célula).
    6. Verifique a formação apertada de monocamadas medindo o TEER (resistência elétrica transeptelial) a cada três dias usando um voltímetro23,de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Realize um espaço em branco, medindo a resistência através de uma inserção de cultura celular sem células, mas com o mesmo meio celular e na mesma placa celular.
      2. Calcule a resistência tecidual subtraindo a resistência em branco da resistência equivalente ao tecido e multiplique pela área de superfície eficaz da membrana do filtro (0,6 cm2). Uma boa resistência à barreira intestinal está em uma faixa de 150 a 400 Ω∙cm2.
        NOTA: Após 21 dias as células devem ser totalmente diferenciadas e a barreira intestinal se formou, de modo que os equivalentes do intestino estão prontos para serem integrados ao MPS.
  2. Produção de equivalentes hepáticos
    1. Manter células HepaRG usando o meio equivalente hepático, que é o E médio de William complementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM L-glutamina, 100 unidades/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 5 μg/mL insulina humana e 5 x 10-5 M hidrocortisona, e é chamado de "Williams E S" neste manuscrito. Renove a mídia HepaRG a cada 2-3 dias e mantenha a cultura celular por duas semanas para iniciar a diferenciação em hepatócitos e cholangiocitos.
    2. Após as duas primeiras semanas, adicione 2% de DMSO ao meio da HepaRG por mais duas semanas para completar a diferenciação celular24,25. Grow HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), usando frascos de cultura celular revestidos de poli-L-lysina, mudando a mídia a cada dois ou três dias.
    3. Retire o meio, lave duas vezes com 1x DPBS e adicione 8 mL de 0,05% Trypsin/EDTA, para dissociar células HepaRG cultivadas em frascos de cultura celular (175 cm2). Incubar por 5 a 10 min a 37 °C e parar a reação adicionando pelo menos o dobro do volume do inibidor de trippsina. Execute o mesmo para HHSTeC, adaptando o volume de reagentes, uma vez que uma quantidade menor dessas células são necessárias e elas podem ser mantidas em frascos menores (75 cm2).
    4. Centrifugar ambos a 250 x g por 5 min, remover o supernasce e resuspensar as pelotas de célula no meio Williams E S. Contar células, assegurando uma viabilidade celular superior a 80%.
    5. Gere os esferoides hepáticos que combinam células HepaRG e HHSTeC a uma proporção de 24:1, respectivamente, no meio Williams E S16. Adicione 4,8 x 104 HepaRG diferenciado e 0,2 x 104 HHSTeC para compor cada esferoide hepático de 50.000 células, em um volume de 80 μL. Ajuste os números e volumes celulares de acordo com o número desejado de esferidas. Misture com cuidado.
    6. Usando uma pipeta multicanal, dispense 80 μL da piscina celular combinada em cada poço de 384 microplatas esferoides, que tem geometria redonda bem inferior.
      NOTA: Após quatro dias, spheróides de cerca de 300 μm são formados.
    7. Usando pontas largas, transfira os esferoides hepáticos para placas de 6 poços de ultra-baixa fixação, o que permite a contagem necessária de "um por um".

2. Integração de equivalentes intestinais e hepáticos em um MPS de 2-OC

  1. Montagem de MPS de intestino 2-OC para ensaio de absorção
    1. Pipeta 500 μL de DMEM S no compartimento maior de 2-OC e 300 μL no menor. Aspire a mídia basolateral e apical de cada barreira intestinal equivalente nas 24 placas do poço. Utilizando fórceps estéreis, integre uma inserção por circuito 2-OC, especificamente no compartimento maior. Aplique 200 μL do meio intestinal no lado apical.
      NOTA: Evite a formação de bolhas ao integrar os organoides ao MPS.
    2. Conecte o MPS à unidade de controle, que deve ser conectada a uma fonte de ar pressurizada. Defina os parâmetros: uma pressão de, aproximadamente, ±300 bar e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hz. Inicie o fluxo 24 horas antes da administração da substância de teste. No dia seguinte, realize o tratamento APAP.
  2. Montagem de Fígado 2-OC MPS para ensaio de metabolismo
    1. Pipeta 650 μL de Williams E S no compartimento grande e 350 μL no compartimento menor, que receberá os esferoides. Nas placas de 6 placas de 6 poços de ultra-baixa fixação, conte os esferoides usando pontas largas. Cada fígado equivalente é composto de vinte esferoides26. Integre vinte equivalentes hepáticos por circuito, utilizando pontas largas, que permitem a transferência apenas de organoides, no compartimento menor de um 2-OC.
    2. Conecte o MPS à unidade de controle, que deve ser conectada a uma fonte de ar pressurizada. Defina os parâmetros: uma pressão de, aproximadamente, ±300 bar e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hz. Inicie o fluxo 24 horas antes da administração da substância de teste. No dia seguinte, realize o tratamento APAP.
  3. Montagem de TPM de intestino/fígado 2-OC para absorção e ensaio de metabolismo
    1. Combine as duas mídias (intestino e fígado) em uma proporção de 1:4, o que significa 200 μL de DMEM S no lado apical do intestino e 800 μL de Williams E S no lado basolateral. Integre os equivalentes intestinais e hepáticos, simultaneamente, no 2-OC.
    2. Conecte o MPS à unidade de controle, que deve ser conectada a uma fonte de ar pressurizada. Defina os parâmetros: uma pressão de, aproximadamente, ±300 bar e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hz. Inicie o fluxo 24 horas antes da administração da substância de teste. No dia seguinte, realize o tratamento APAP.
      NOTA: Para todos os experimentos, realize cada ponto de tempo em triplicado, o que significa três circuitos separados de 2-OC (ou seja, 1 e 1/2 dispositivos 2-OC). O volume total de cada circuito de 2-OC é de 1 mL.

3. Preparação de acetaminofeno (APAP)

  1. Prepare a solução de estoque apap, dissolvendo APAP em etanol absoluto. No dia do experimento, diluir o APAP no respectivo meio (solução APAP), a uma concentração de 12 μM para "administração oral" e 2 μM para "administração intravenosa".
  2. Garantir que a concentração final de etanol na solução de controle e tratamento de veículos seja de 0,5% para ambas as administrações. Para o controle positivo (100 mM APAP), a concentração de etanol é de 2%.

4. Administração de substâncias de teste e amostragem de mídia

  1. Administração "oral" da APAP e amostragem de mídia
    1. Aspire a mídia basolateral e apical de cada barreira intestinal equivalente no 2-OC. Pipeta 500 μL do meio de cultura apropriado no grande compartimento no lado organoide basolateral e 300 μL no pequeno compartimento.
    2. Verifique se há bolhas e proceda com o tratamento equivalente da barreira intestinal com a substância de teste no lado apical, emulando a administração oral. Emular a administração "oral" apap adicionando 200 μL de uma solução APAP de 12 μM no lado apical das pastilhas de cultura intestinal, que representa o "lado lúmen" intestinal(Figura 1B). Conecte o MPS à unidade de controle.
    3. Recolher o volume total dos lados apical e basolateral nos seguintes pontos de tempo: 0h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3h, 6h, 12 h e 24h15,27. Realize todos os experimentos em triplicado, em condições estáticas e dinâmicas, e colete cada amostra de cada triplicado, em um microtubo separado. Analise as amostras usando HPLC/UV.
      NOTA: Separar amostras apical e basolateral.
  2. Administração "endovenosa" da APAP e amostragem de mídia
    1. Emule a rota "intravenosa" administrando a solução APAP de 2 μM diretamente no compartimento do fígado. Aspire todo o conteúdo médio 2-OC. Pipeta 650 μL de Williams E S contendo a substância de teste no compartimento grande e 350 μL da mesma mídia no compartimento menor que contém os 20 esferoides. Recolher todos os volumes nos seguintes pontos de tempo: 0h, 30 min, 1h, 2h, 3h, 6h, 12h e 24h27,28.
    2. Realize todos os experimentos em triplicado, em condições estáticas e dinâmicas. Colete cada amostra de cada triplicado, em um microtubo separado. Analise as amostras usando HPLC/UV.

5. Instrumentação e condições cromatográficas

  1. Análise HPLC
    1. Defina todos os parâmetros relevantes para a análise do HPLC de acordo com a Tabela 1.
    2. Filtre a fase móvel através de um filtro de membrana de 0,45 μm sob vácuo. Filtre as amostras através de um filtro de seringa PVDF tamanho 0,22 μm (diâmetro 13 mm) e armazene-as em um frasco. Comece a medição.
  2. Soluções de estoque, padrões de calibração e amostras de controle de qualidade (QC)
    1. Prepare 10 mM de soluções de estoque APAP em tampão de acetato de amônio (100 mM, pH 6.8) e diluir ainda mais com a mídia de cultura celular DMEM S e Williams E S diluída com tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) para alcançar as soluções de trabalho que variam de 0,25 a 100,00 μM.
    2. Inclua um conjunto de amostras de calibração em triplicado, bem como amostras de controle de qualidade em quatro níveis em triplicado. Prepare esses padrões por diluição serial.
    3. Crie curvas de calibração das áreas de pico APAP versus concentrações padrão nominais APAP. Determine a regressão linear adequada para cada curva de calibração. Avalie a bondade de ajuste de vários modelos de calibração por inspeção visual, coeficiente de correlação, precisão intra e inter-execução e valores de precisão.
    4. Injete amostras em branco da mídia DMEM S e Williams E S diluídas em tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) em sextuplicato. Prepare triplicados de amostras de controle de qualidade em mídia DMEM S e Williams E S diluídas com tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) para as concentrações APAP de 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 e 90,00 μM.
    5. Certifique-se de que as amostras de controle de qualidade sejam preparadas a partir de uma nova solução de estoque, diferente da usada para gerar uma curva padrão. Use amostras de controle de qualidade para investigar variações intra e inter-execut.
  3. Procedimentos de validação
    1. Realizar a validação do método bioanallítico seguindo os procedimentos relatados anteriormente29,30. Realizar as corridas cromatográficas em cinco ou seis ocasiões distintas, considerando os meios de cultura celular Williams E S e DMEM, respectivamente.
    2. Certifique-se de que os pontos de calibração que variam de 0,25 a 100,00 μM de APAP, em mídia de cultura celular DMEM S ou Williams E S diluídas em tampão de acetato de amônio (1:1, v/v), são plotados com base nas áreas de pico do APAP (eixo y) contra as respectivas concentrações nominais (eixo x). Compare as inclinações dessas curvas de calibração padrão com inclinações da curva de calibração preparadas no tampão de acetato de amônio. Certifique-se de que todas as curvas de calibração tenham um valor de correlação de pelo menos 0,998.
    3. Determine a precisão e a precisão (intra e inter-run) para o analito na matriz de substitutos usando réplicas em quatro níveis diferentes de controle LLOQ, baixo, médio e de alta qualidade em cinco ou seis dias diferentes. Realize medições de precisão e precisão intra-executadas no mesmo dia em mídia de cultura celular DMEM S ou Williams E S diluída em tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) contendo concentrações APAP 0,50, 4,50, 45,00 e 90,00 μM (n= 3).
    4. Avalie cada conjunto de amostras de controle de qualidade contendo as concentrações APAP das curvas de calibração obtidas recentemente. Teste a seletividade dos ensaios pelo grau de separação do composto de interesse e possíveis outros picos cromatográficos causados por componentes interferentes.
  4. Menor limite de quantificação (LLOQ) e limite de detecção (LOD)
    1. Determine o limite inferior de quantificação (LLOQ) com base no desvio padrão da resposta e da abordagem da inclinação. Calcule usando a fórmula 10α/S, onde α é o desvio padrão do y-intercept e S é a inclinação da linha reta obtida pelo plotagem das curvas de calibração29,30. Estime o limite de detecção (LOD) levando em consideração 3,3 vezes o desvio padrão do em branco, dividido pela inclinação da curva de calibração29,30.

6. Equivalentes teciduais viabilidade/funcionalidade

  1. Mtt
    1. Realize um ensaio MTT para avaliar a viabilidade organoide em todos os pontos de tempo do ensaio mps. Como controle negativo, use mídia celular mais veículo. Como controle positivo, trate os organoides com APAP de 100 mM e 1% NaOH diluído no meio celular.
    2. Transfira os 20 esferoides de cada réplica para poços individuais em uma placa de 96 poços, e a cultura celular insere, contendo os equivalentes do intestino, para 24 placas de células bem, colocando um intestino equivalente por poço. Lave os equivalentes teciduais três vezes com 1x DPBS.
    3. Adicione 300 μL de uma solução MTT de 1 mg/mL, diluída no meio celular respectivo, por poço. Incubar as placas por 3h em condições padrão de cultura celular.
    4. Remova a solução MTT de cada poço cuidadosamente por pipetação. Extrair formazan MTT do intestino e equivalentes hepáticos usando 200 μL de isopropanol por poço durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Sele a tampa para evitar a evaporação.
    5. Transfira 200 μL de cada supernante para o respectivo poço pré-identificado em uma placa de teste de 96 poços. Use isopropanol como o branco.
    6. Leia a absorção de formazan em um leitor de placas a 570 nm. Calcule a capacidade relativa das células de reduzir mTT (%) utilizando a densidade óptica média de cada ponto de tempo, em comparação com o controle negativo, considerado como viabilidade celular 100%.
  2. Citoquímica/Histologia
    1. Fixar o intestino e os equivalentes hepáticos, por 25 min à temperatura ambiente, utilizando 4% (w/v) paraformaldeído em 0,1 M tampão de fosfato-salino, pH 7.4. Lave os organoides 5 vezes no buffer PBS por 10 minutos cada vez. Manche o intestino e os equivalentes hepáticos com tetrametilrhodamina isothiocyanato-phalloidin ou Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 em PBS31.
    2. Transfira-os para o meio de congelamento de OUTUBRO por alguns minutos para aclimatar na RT antes de transferi-los para nitrogênio líquido até o congelamento completo. Realize crioseções hepáticas criosections cerca de 10-12 μm de espessura, usando um criostat.
    3. Monte as seções teciduais em meio de montagem com DAPI. Examine-os por microscopia de fluorescência confocal.
    4. Congele os organoides após a fixação para realizar a coloração de hematoxilina e eosina de acordo com os protocolos estabelecidos. Monte os slides com meio de montagem depois de cortar o tecido como descrito acima e pegue imagens histológicas usando um microscópio óptico.
  3. Análise de alto teor de conteúdo
    1. Coloração mitocondrial e nuclear das células
      1. Reconstitua o pó liofilizado no DMSO para fazer uma solução de estoque de coloração mitocondrial de 1 mM (por exemplo, MitoTracker Deep Red FM). Armazene a solução de estoque aliquoted a -20 °C protegida contra a luz. Diluir a solução de coloração mitocondrial de 1 mM para a concentração final (200 nM) em meio de cultura tecidual pré-armado (37 °C) sem soro.
      2. Remova a mídia de cultura celular. Adicione a solução de coloração mitocondrial para cobrir completamente a amostra e incubar células por 15-45 min a 37 °C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
      3. Remova cuidadosamente a solução de funcionamento da coloração mitocondrial e substitua-a por 2-4% de fixação de paraformaldeído em PBS por 15 minutos à temperatura ambiente.
      4. Enxágüe as células fixas suavemente com PBS por 5 minutos. Repita o processo de lavagem duas vezes.
      5. Prepare uma solução de estoque de coloração de ácido nucleico de 10 mg/mL (16,23 M) dissolvendo 100 mg de corante Hoechst 33342 em 10 mL de água ultrapura.
        NOTA: A solução de estoque deve ser aliquoted e armazenada protegida contra luz a -20 °C.
      6. Prepare uma solução de trabalho de coloração de ácido nucleico 0,2-2,0 μg/mL em PBS e incuba as células fixadas com solução de coloração de ácido nucleico por 10 minutos à temperatura ambiente.
      7. Remova a solução de funcionamento da coloração de ácido nucleico e enxágue as células suavemente com PBS por 5 minutos três vezes. As células devem ser mantidas em PBS a 4 °C, protegidas da luz.
    2. Análise de coloração mitocondrial e nuclear
      1. Analise as células usando um microscópio de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados para a mancha de ácido nucleico (λEx/ λEm: 361/497 nm) e a mancha mitocondrial (λEx/ λEm: 644/665 nm). Encontre células por coloração positiva de ácido nucleico e quantifique o número celular. Quantificar a intensidade da fluorescência da mancha mitocondrial nas mitocôndrias.
  4. Medições morfométricas (cálculos esferoides) em ImageJ
    1. Export High Content Analysis (HCA) imagens como arquivos *.flex do software Columbus. Importar arquivos .flex como uma escala de cinza no ImageJ usando o plugin Bio-Formats32: File > Import > Bio-Formats.
    2. Na janela Opções de importação, selecione a visualização do Hyperstack e habilite canais Split em Dividir em janelas separadas. Esta opção permitirá o acesso de todos os arquivos em um determinado canal (por exemplo, DAPI, mitotracker, etc.). Não selecione Usar pilha virtual no gerenciamento Memória.
      NOTA: É preferível usar o canal DAPI como "poeira" em imagens, pois o meio de cultura é reduzido em comprimento de onda UV (por exemplo, 405 nm).
    3. Ajuste o tamanho do pixel(Analyze > Set Scale)se ele não foi carregado de acordo com os valores incorporados no arquivo .flex. Aplique um filtro Gaussian Blur para remover o excesso de ruído e evitar irregularidades no contorno de forma. Processo > Filtros > Gaussian Blur. Um alto valor de Sigma (raio) entre 2.0 e 3.0 é ideal para a maioria dos casos. Se a pilha tiver várias imagens, aplique-se a todas elas (selecione Sim na janela Process Stack).
    4. Gere uma imagem binária para separar fundos e organoides (objetos) usando um limiar. Clique em Imagem > Ajuste > Limiar. Use a máscara vermelha para ajustar os valores de acordo com a intensidade da imagem, para se encaixar na forma organoide, mantendo a morfologia intacta. Desabilitar fundo escuro se a imagem tiver um fundo branco. Clique em Aplicar.
    5. Na janela Converter pilha para binário, escolha o método Limiar. Normalmente, Padrão ou Triângulo são preferidos neste tipo de processamento de imagem. Mantenha o fundo como escuro. Selecione Calcular limiar para cada imagem se houver várias imagens na pilha.
    6. Selecione Processo > Binário > Preencher furos. Opcionalmente, remova os orifícios do fundo. Em Process > Binary > Options, selecione fundo preto e execute Fill Holes novamente. Desabilitar a opção de fundo Black antes de prosseguir para o próximo passo.
    7. Objetos separados. Para organoides, o método da bacia hidrográfica é uma boa escolha. Clique em Process > Binary > Watershed. Execute a análise de forma.
      1. Selecione Analisar > Definir medidas. Várias opções estão disponíveis (detalhes em https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Para organoides, selecione Área, Valor cinza médio, valor cinza min & max e descritores de forma. Opcionalmente, selecione Exibir rótulo para identificar objetos na imagem e notação científica. Clique em OK.
      2. Selecione Análise > Analisar partículas. Escolha os limites de tamanho e circularidade. Mantenha 0-infinito e 0.00-1.00, respectivamente para medir todos os objetos na imagem. Em Show, escolha Contornos para que os objetos sejam identificados. Habilitar os resultados do Display para os resultados de saída; Excluir nas bordas para excluir objetos que toquem fronteiras; Inclua furos para que eventuais orifícios internos nos objetos sejam considerados como parte da forma principal.
    8. Análise de forma repetida para cada pilha de imagens e os resultados serão anexados em uma única tabela. Tabela de resultados de exportação no arquivo > Salvar Como... como arquivo Valores Separados de Vírgula (.csv).
  5. PCR em tempo real
    1. Extrair RNA de equivalentes teciduais usando uma solução monofásica de isothiocnato de fenol e guanidina, seguindo as instruções do fabricante.
    2. Realize a síntese cDNA por transcrição reversa de 1 – 2 μg de RNA total.
    3. Amplie todos os alvos usando primers específicos de genes(Tabela 5) para executar PCR quantitativo em tempo real. Cada qRT-PCR contém 30 ng de RNA transcrito reverso e 100 nM de cada primer.
    4. Siga as condições do PCR: 50 °C por 3 minutos (1 ciclo); 95 °C por 5 minutos (1 ciclo); 95 °C durante 30 segundos, 59 °C durante 45 segundos e 72 °C por 45 segundos (35 - 40 ciclos).
  6. Ensaio CYP
    1. Siga a seção 2.2 para montagem de fígado 2-OC. Os grupos experimentais são controle sem células, tratamentos APAP 2 μM para 12 h, 24 h e controle do veículo. Siga as seções 3.3 e 4.2 para preparação e tratamento APAP 2 μM.
      NOTA: Para garantir que todas as amostras estejam prontas ao mesmo tempo para o ensaio CYP, inicie o tratamento de 12h 12 horas após o início do tratamento de 24h. Trate o controle sem células da atividade CYP com solução de etanol de 0,5%, bem como o controle do veículo.
    2. Descongele a solução de estoque de substrato luminogênico de 3 mM à temperatura ambiente e faça uma diluição de 1:1000 no William's E S. Proteja da luz.
    3. Colete esferoides e transfira cada grupo experimental para um poço de placa de 96 poços. Retire o meio, lave duas vezes com 100 μL de 1x DPBS e adicione 80 μL de solução de substrato de 3 μM por poço. Mantenha o controle sem células no meio E S do William. Salve um poço sem esferoides ou solução de substrato para um controle de fundo. Incubar por 30-60 min a 37 °C com 5% de CO2,protegido da luz.
    4. Reagente de detecção de lúciferina liofilizada (LDR) utilizando o Buffer de Reconstituição com esterase. Misture girando ou invertendo. Armazene o volume apropriado à temperatura ambiente até o próximo passo.
      NOTA: O LDR reconstituído pode ser armazenado em temperatura ambiente por 24 horas ou a 4 °C durante 1 semana sem perda de atividade. Para armazenamento a longo prazo, armazene a -20 °C.
    5. Transfira 25 μL de supernanato de spheróides intactos em três poços diferentes de uma microplape branca opaca de 96 poços, após a incubação. Adicione 25 μL de LDR por poço e homogeneize.
    6. Incubar a placa branca em temperatura ambiente por 20 minutos. Leia a luminescência em um luminômetro. Não use um fluorômetro.
    7. Calcule sinais líquidos subtraindo valores de luminescência de fundo (controle sem célula) dos valores tratados por compostos de teste e não tratados (controle do veículo). Calcule a variação percentual da atividade CYP3A4 dividindo os valores líquidos tratados pelos valores líquidos não tratados e multiplicando por 100.
  7. Mancha ocidental
    1. Transfira os esferoides hepáticos para um microtubo identificado de 1,5 mL. Retire o meio e lave duas vezes com 100 μL de 1x DPBS.
    2. Lise os esferoides hepáticos em 100 μL de tampão RIPA de lise celular a 4 °C por 20 minutos. Centrífuga por 15 min, 4 °C e 11000 rpm. Transfira o supernatante para outro microtubo identificado de 1,5 mL.
    3. Quantifique a quantidade de proteína obtida através do método Bradford. Carregue entre 10 e 50 μg de proteína do lysato celular quantificado por poço de um gel de poliacrilamida gradiente 3-15% e realize um SDS-PAGE.
    4. Transfira a proteína carregada do gel para uma membrana PVDF de 0,22 μm através do equipamento do sistema semi-seco. Use uma solução de transferência de 50 mM Tris-HCl e 192 mM de glicacina. Defina os parâmetros do equipamento de acordo com o número de géis a serem transferidos (1 a 2 de cada vez).
    5. Bloqueie interações não específicas na membrana PVDF com uma solução de leite desnatado de 3-5% no buffer TBS-T: Soro fisiológico tris-tampão (50 mM Tris pH 7,6, 150 mM cloreto de sódio) complementado com 0,1% de Tween 20. Mantenha a membrana sob suavemente agitação constante por 1 hora em temperatura ambiente.
    6. Lave com TBS-T sob agitação suavemente constante por 3-5 min em temperatura ambiente. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
    7. Diluir albumina e vinculin anticorpos primários para 1:1000 e 1:2000, respectivamente, no TBS-T. Incubar a membrana com anticorpos primários durante a noite a 4 °C, sob agitação suavemente constante.
      NOTA: Siga sempre as instruções do fabricante para diluir anticorpos.
    8. Remova o anticorpo primário e lave a membrana 3 vezes (passo 6.7.6). Diluir o anticorpo secundário IgG anti-mouse da ECL para 1:5000 no TBS-T. Incubar a membrana com um anticorpo secundário sob agitação suavemente constante por 2 horas em temperatura ambiente.
    9. Remova o anticorpo secundário e lave a membrana (passo 6.7.6). Realize a detecção de proteínas usando o Substrato de Mancha Ocidental ECL. Expor os filmes autordiográficos por 30 a 30 min. Realize a detecção de imunoblotting em triplicado.

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Representative Results

Para realizar os testes PK APAP no MPS de 2-OC, o primeiro passo é fabricar o intestino humano e equivalentes hepáticos (organoides). Eles são integrados ao dispositivo microfluido 2-OC(Figura 1A) 24 h antes do início do ensaio PK APAP. No dia seguinte, o meio é alterado, e o modelo é exposto ao APAP. A Figura 1 ilustra os equivalentes do intestino e fígado colocados dentro do dispositivo 2-OC(Figura 1B) e do curso de tempo de experimento APAP PK(Figura 1C). Realizamos um ensaio MTT, medições de TEER, HCA, PCR em tempo real, mancha ocidental, histologia e microscopia de fluorescência confocal na cultura 2D e organoides 3D para verificar a viabilidade do tecido e detectar possíveis efeitos tóxicos APAP. Nas imagens de microscopia de fluorescência confocal, as amostras equivalentes do intestino manchadas com DAPI e Phalloidin (para núcleos e actina, respectivamente) foram apresentadas como barreira contígua para as não tratadas (Figura 2A) e as 12 amostras tratadas APAP(Figura 2B). Como visto na Figura 2C,o ensaio MTT mostrou níveis relativos de viabilidade celular acima de 70%, indicando a ausência de efeitos citotóxicos relevantes em resposta à exposição apap na concentração de 12 μM33,34,35,36,37. O controle positivo (100 mM) induziu morte celular significativa (sobrevida abaixo de 5%). A viabilidade caco-2/HT-29 e a diferenciação adequada, bem como a integridade da barreira equivalente do intestino foram verificadas pela evolução do TEER durante o período de diferenciação(Figura 2D). A APAP não causou qualquer alteração nos valores teer, como mostrado na Figura 2E. Foram analisadas a expressão dos transportadores ativos de glicose acoplado ao sódio SLC5A1, o transportador de resistência multidroga MDR1 e o ATPase de potássio de sódio, para verificar o impacto do tratamento APAP sobre a formação de barreiras celulares e a funcionalidade basal. Como demonstrado na Figura 2F-H,tanto os equivalentes intestinais tratados não tratados quanto apap mostraram expressão semelhante de SLC5A1 e NaKATPase. A administração oral de 12 μM APAP induzida marcou um aumento nos níveis de MDR1 mRNA em equivalentes intestinais após 24 h(Figura 2H). Também realizamos alterações fenotípicas de células por uma mistura de corante fluorforeiro para o conteúdo de massa nuclei e mitocondrial. Os controles positivos foram de 100 mM APAP e 1% naOH.

Além disso, analisamos se 12 μM APAP poderia induzir a citotoxicidade à co-cultura 2D Caco-2/HT-29. As imagens das células intestinais adquiridas com microscopia de fluorescência mostrada na Figura 2I corroboram os dados do MTT, que demonstraram que 12 μM APAP não causaram citotoxicidade significativa nos equivalentes intestinais Caco-2/HT-29.

A avaliação da viabilidade basal dos esferoides hepáticos e a citotoxicidade em resposta a 2 μM APAP foram feitas por ensaios MTT e análises morfológicas por microscopia de fluorescência confocal, histologia de H&E e HCA. Como mostrado na Figura 3A,o ensaio MTT não foi capaz de identificar qualquer citotoxicidade relevante em resposta ao tratamento de APA de 2 μm em amostras colhidas do conjunto Fígado 2-OC em condições estáticas e dinâmicas. A viabilidade celular diminuiu, mas permaneceu acima de 80% tanto para 12 h quanto 24h de pontos33,34,35,36,37. Os tratamentos de controle positivo (100 mM APAP e 1% NaOH) induziram danos teciduais significativos (viabilidade abaixo de 10%). Imagens confocal microscópicas indicam a ausência de um centro necrosado nos esferoides hepáticos em condições de tratamento basal ou APAP, e nenhuma evidência de taxas de mortalidade significativas(Figura 3B-C). No entanto, quando analisamos múltiplas alterações fenotípicas celulares após o veículo ou administração APAP de 2 μM na cocultura 2D HepaRG/HHSteC através do ensaio HCA, utilizando 100 mM APAP (C+) como controle positivo, contraditoriamente aos resultados do ensaio MTT, as células hepáticas demonstraram respostas citotóxicas precoces a 2 μMAP tratamento AP (Figura 3D). Após 24 h, houve diminuição no número de células, na área nuclear e aumento da massa mitocondrial. Além disso, um coquetel de corante fluoróforo contendo Hoechst 33342 e MitoTracker Deep Red foi usado para manchar os esferoides hepáticos 3D(Figura 3J). O software Fiji foi utilizado para avaliar a homogeneidade da arquitetura esférica 3D entre vários esferoides(Figura 3E-I). O gráfico mostrado na Figura 3E mostra a semelhança entre a área total dos spheróides hepáticos. A proporção (Figura 3F) em torno de 1 significa ausência de viés durante o processo de confecção dos esferoides. A avaliação também indicou que a maioria dos esferoides foram aproximadamente arredondados(Figura 3G). A avaliação do perímetro de morfologia e da distribuição celular foi feita por circularidade (Figura 3I) e pelo cálculo de solidez(Figura 3H), respectivamente. Concluiu-se que a metodologia de confecção dos esferoides hepáticos gerou organoides com perímetro liso, compatível com crescimento esférico, sem vieses ou necrose durante o processo.

Como demonstrado na Figura 4A-B,os spheróides hepáticos mostraram um alto nível basal relativo de albumina e expressão gst mRNA, respectivamente, indicando funcionalidade basal adequada. No entanto, o tratamento APAP de 2 μM para 24 h induziu uma diminuição nos níveis de expressão de albumina e gst mRNA, sugerindo comprometimento de esferoides hepáticos funcionalmente em 24 horas ponto de tempo do tratamento APAP.

A detecção dos níveis de expressão CYP3A4 e UGT1A1 mRNA demonstra a capacidade metabólica dos equivalentes hepáticos. O nível basal CYP3A4 mRNA (Figura 4C) foi consistente com os relatórios anteriores6. O tratamento APAP induziu uma tendência de diminuição tanto na expressão CYP3A4 mRNA quanto ugt1A1 em resposta ao tratamento APAP (Figura 4C-D) corroborando mais uma vez a hipótese de comprometimento dos esferoides hepáticos funcionalmente no ponto de tempo de 24 horas do tratamento APAP.

Além disso, foram realizados experimentos de manchas ocidentais e atividade enzimática in vitro para analisar a expressão da proteína albumina, bem como, a atividade CYP 3A4 em equivalentes hepáticos em condições de tratamento basal e em APAP. Descobrimos que o tratamento APAP de 2 μM realizado no Liver 2-OC MPS, induziu uma redução na expressão total de albumina equivalente hepática em 12 h e 24 h pontos de tempo em condições estáticas(Figura 4E) e dinâmica(Figura 4F). Por outro lado, amostras de equivalentes hepáticos de condições dinâmicas demonstraram uma tendência de apresentar níveis mais elevados de expressão proteica da albumina quando comparadas às condições estáticas(Figura 4G). O ensaio in vitro CYP 3A4 realizado em equivalentes hepáticos do Fígado 2-OC MPS mostrou que o tratamento APAP de 2 μM por 12 h ou 24 h foi capaz de induzir um comprometimento robusto e significativo da atividade CYP 3A4 em condições estáticas e dinâmicas(Figura 4H-I). Mais interessante, a presença de fluxo de mídia (dinâmica) induziu uma melhora significativa dos níveis de atividade cyp 3A4 em comparação com as condições em que os equivalentes hepáticos foram mantidos na ausência de meio circulante (condições estáticas) (Figura 4J).

Para encontrar a condição analítica mais sensível em relação à análise do HPLC, foram investigados diversos parâmetros, incluindo a composição da fase móvel, do tipo e concentração de aditivos. Descobriu-se que o acetonitrilo deu melhor resolução de cromatógrama e tempo de retenção adequado do que o metanol. A separação rápida e reprodutível do APAP foi obtida utilizando-se uma coluna de fase inversa C18. O valor do tempo de retenção apap (Rt) foi de 9,27 ± 0,19 minutos. A seletividade para APAP é indicada pela forma e resolução simétrica do pico, bem como pela falta de picos interferentes dos meios de cultura celular DMEM e Williams.

Concentrações padrão APAP em mídia de cultura celular DMEM S e Williams E S diluídas com tampão de acetato de amônio (1:1, v/v) variando de 0,25 a 100,00 μM foram usadas para construir as curvas de calibração. A linearidade do método foi determinada em nove níveis de concentração. Os dados são mostrados na Tabela 2 e Tabela 3. A relação entre a concentração de APAP e as áreas de pico foi descrita pelas equações de regressão linear: y = 16106 * x + 3579,8 (R2=1, em média DMEM) e y = 16397 * x + 2475,1 (R2=1, em média Williams), em que "x" é concentração nominal APAP em μM e "y" é a área de pico de cromatógrama de APAP em UA. No limite superior de quantificação (ou seja, 100,00 μM), o desvio percentual e os valores de variabilidade entre execuções foram inferiores a 2,50%. A precisão e a precisão para nove níveis de concentração, excluindo os 0,50 μM (LLOQ), estavam dentro de uma faixa aceitável com valores DEV e C.V. inferiores a 7,00%(Tabela 2 e Tabela 3).

O método analítico de precisão e precisão intra-executada, em quatro concentrações testadas, caiu dentro dos critérios geralmente aceitos para ensaios bioanalíticos. A reprodutibilidade do método foi avaliada pela análise de réplicas de amostras de controle de qualidade APAP de 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 e 90,00 μM. Os resultados médios intra-run e inter-run são relatados na Tabela 4. A precisão e precisão do ensaio são demonstradas pelos valores DEV ≤ 15,00% e pelos valores C.V. ≤ 7,00%, respectivamente.

O LOD foi determinado como a amostra cuja relação sinal-ruído (S/N) era pouco maior que 3 e correspondia a um APAP de 0,25 μM. Por outro lado, o LLOQ, estimado com amostras apap de 0,50 μM, apresentou razão S/N igual a 10. Além disso, encontramos valores de precisão (DEV%) variando dentro ≤ 19,00% dos valores de concentração nominal. As variabilidades intra e inter-run foram demonstradas por C.V. ≤ 18,77%, conforme mostrado na Tabela 2, Tabela 3 e Tabela 4)29,30.

As análises apap PK foram realizadas em três diferentes conjuntos de 2-OC MPS: 1) Intestino 2-OC, contendo apenas o equivalente do intestino; 2) Fígado 2-OC, contendo apenas os esferoides hepáticos e 3) Intestino/Fígado 2-OC com barreira intestinal e esferoides hepáticos.

Para estudos de absorção, a rota oral foi imitada pela administração de 12 μM APAP no lado apical equivalente do intestino. As concentrações de APAP foram medidas pelo HPLC/UV, nas amostras médias, coletadas a partir de equivalentes intestinais apical e basolateral, tanto em condições estáticas quanto dinâmicas. A cinética APAP no meio coletada dos lados apical e basolateral demonstrou que o modelo intestinal foi capaz de absorver o APAP. Houve uma diminuição progressiva da concentração de APAP no lado apical (Figura 5A) concomitantemente ao aumento da concentração de APAP no lado basolateral intestinal(Figura 5B). As concentrações máximas (Cmax) no médio foram de cerca de 2 μM para condições estáticas e dinâmicas, após 12h da administração (Tmax).

Para estudos de metabolismo, a administração intravenosa foi imitada pela aplicação de 2 μM APAP no meio do compartimento hepático. A cinética de concentração DE APAP na mídia sob condições estáticas e dinâmicas indicou que apenas nas condições dinâmicas as reduções na concentração de APAP poderiam ser detectadas, atingindo 0,87 μM APAP 12 h após a administração apap de 2 μM (T1/2 = 12 h). Os equivalentes hepáticos apresentaram eficiência metabólica mínima em condições estáticas(Figura 5C). A concentração de APAP atingiu 1,7 μM 12 h após a administração da APAP. A avaliação integrada e sistêmica como a absorção de APAP e o metabolismo foi realizada no modelo Intestino/Fígado 2-OC. O APAP foi administrado sobre o lado apical do equivalente do intestino, emulando a rota oral. Foram coletadas amostras médias tanto dos lados intestinais quanto do compartimento hepático. A Figura 5D mostra a progressiva decadência da concentração de APAP no lado apical em condições estáticas e dinâmicas.

A Figura 5E mostra fases distintas de absorção e metabolismo. O fluxo também impactou na absorção intestinal. O APAP Cmax no meio mudou de 2 μM no conjunto "Intestino 2-OC"(Figura 5B) para 1,7 μM para o dinâmico "Intestino/Fígado 2-OC"(Figura 5E). A Figura 5F mostra uma comparação direta entre o perfil de concentração-tempo da APAP em nosso dinâmico sistema microfisiológico "Intestino/Fígado 2-OC" (curva vermelha e eixo y) e um perfil representativo obtido em humanos após uma única dose oral de 1000 mgs (curva preta e eixo y).

Figure 1
Figura 1: Compilação de etapas esquemáticas para estudos de PK no MPS 2-OC. A) Desenho esquemático do MPS 2-OC, mostrando os equivalentes de tecido humano intestinal e hepático na visão inferior para cima. B) Fotografia de 2-OC MPS com os equivalentes intestinal e hepático integrados ao dispositivo na visão inferior para cima, com imagens de microscopia óptica representativa. C) Linha do tempo de preparação de equivalentes teciduais, tratamento APAP e fases de coletas médias de cultura para fabricação organoide, e avaliações farmacocinéticas e toxicológicas. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Viabilidade e avaliação toxicológica dos equivalentes do intestino. A) Imagens representativas de microscopia de fluorescência confocal de células caco-2/HT-29 não tratadas manchadas com núcleos celulares e filamentos de actina (DAPI e Phalloidin, respectivamente); 63x Ampliação, zoom 2.6. B) Imagens representativas de microscopia de fluorescência confocal de células caco-2/HT-29 tratadas com APAP de 12 μM por 24 h, manchadas com núcleos e filamentos de actina corante fluorescente (DAPI e Phalloidin, respectivamente); 63x Ampliação, zoom 2.6. C) A avaliação de viabilidade do intestino por ensaio MTT em condições estáticas e dinâmicas. Os valores representados pelas barras no gráfico são calculados por cento em relação ao controle do veículo (ponto de tempo nomeado como 0)*P<0,05 0 versus tratamento. D) Evolução do TEER durante os 21 dias de diferenciação. *P<0,05 dia 1 vs outros dias. E) Valores de TEER após a administração apap no Intestino 2-OC MPS em condições dinâmicas. Expressão genética em intestinos equivalentes. O potencial de absorção da barreira intestinal e possíveis efeitos de 12 μM APAP por 24 h em condição dinâmica foi verificado pela expressão SLC5A1(F),Na-K-ATPase (G) e MDR1(H). Os valores representam a média ± SEM de três experimentos independentes. O resultado é expresso como uma razão para a limpeza GAPDH. *P<0.05 veículo vs APAP. I) HCA baseada em imagem de Operetta realizada pelo Colombo® 2.4.0. Software. Imagens representativas da cocultura intestinal 2D em diferentes pontos de tempo após o tratamento APAP de 12 μM. Os controles negativos foram médios (0h) ou veículo (0,5% etanol). Controles positivos mostrados aqui é o APAP de 100 mM. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Viabilidade e avaliação toxicológica dos equivalentes hepáticos. A) Avaliação de viabilidade de equivalentes hepáticos pelo ensaio MTT em condições estáticas e dinâmicas. Os valores representados pelas barras no gráfico são calculados por cento em relação ao controle do veículo (ponto de tempo nomeado como 0) *P<0,05 0 vs tratamento. B) Representantes de imagens confocal capturadas do veículo e 2 μM APAP 24 h tratadas de fígado de uma seção interna. C) Representantes Imagens de H&E (hematoxylin e eosina) capturadas do veículo e 2 μM APAP 24 h tratadas spheroids de fígado de uma seção interna. Barra de escala = 50 μm. D) Imagens representativas da cocultura hepática 2D em diferentes pontos de tempo após o tratamento APAP de 2 μM. Foram consideradas amostras tratadas com veículo e com APAP de 2 μM nestas análises. A mistura de corante fluorforeiro inclui Hoechst para coloração nuclear e Mitotracker Deep Red para coloração em massa mitocôndrias. Os controles negativos foram médios (0h) ou veículo (0,5% etanol). Os controles positivos foram de 100 mM APAP. Medições de imagens de esferoides inteiras capturadas foram realizadas usando o software Fiji. E) Distribuições de frequência da área F) proporção, G) arredondamento, H) solidez, I) circularidade. N = 85. *p < 0,05. J) Imagens representativas de esferoides hepáticos 3D adquiridos pela Operetta utilizando o objetivo LWD 10x. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Viabilidade/funcionalidade hepática e possíveis efeitos de 2 μM APAP em condições estáticas e dinâmicas sobre ele foram verificados pela expressão genética e proteica e pela atividade enzimática. A) expressão genética albumina. B) Expressão genética GSTA2. A capacidade hepática para realizar o metabolismo da fase I e da fase II e possíveis efeitos de 2 μM APAP por 24 h em condição dinâmica sobre ele foram verificados pela expressão genética de CYP3A4 (C) e por UGT1A1 (D),respectivamente. E) Expressão total da proteína albumina sob condição estática. F) Expressão total da proteína albumina em condições dinâmicas. Condição. G) Gráfico comparativo ilustrando a diferença na expressão total da albumina em equivalentes hepáticos cultivados e tratados sob condições estáticas ou dinâmicas. H) CYP 3A4 atividade enzimática in vitro em condições estáticas. I) CYP 3A4 atividade enzimática in vitro em condições dinâmicas. J) Gráfico comparativo ilustrando a diferença na atividade CYP 3A4 em equivalentes hepáticos cultivados e tratados sob condições estáticas ou dinâmicas. Os valores representam a média ± SEM de três experimentos independentes. Os dados da expressão genética são expressos como uma razão para a limpeza GAPDH. Os dados de expressão proteica são expressos como uma razão para a proteína vinculina. *Tratamento P<0.05 veículo vs APAP. Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análises da farmacocinética APAP em 2-OC MPS. Perfil de absorção APAP após administração APAP de 12 μM no lado apical da preparação do MpS do Intestino 2-OC. A barreira intestinal foi feita de uma cocultura das linhas celulares Caco-2/HT-29(A)Concentrações estáticas e dinâmicas de APAP no meio do lado apical (representando o lado do lúmen intestinal humano). (B) Concentrações estáticas e dinâmicas de APAP no meio do lado basolateral (representando o lado da corrente sanguínea intestinal humana). *P<0,05 condições estáticas versus dinâmicas. C) Perfil do metabolismo APAP no Fígado 2-OC MPS por spheróides hepaRG/HHSTeC. Comparação de condições estáticas e dinâmicas após uma administração APAP de 2 μM no meio. *P<0,05 0h vs 6 h, 12 h e tratamento APAP 24h. Absorção de APAP e perfil de metabolismo após administração de 12 μM no lado apical da barreira intestinal da preparação do Intestino/Fígado 2-OC MPS. Isso emula a rota oral. A barreira intestinal foi feita de linhas celulares Caco-2/HT-29 e o equivalente hepático feito de esferoides de linhas celulares HepaRG/HHSTeC. (D) Concentrações de APAP intestinal/fígado 2-OC no lado apical da barreira intestinal em condições estáticas e dinâmicas. (E) Concentrações de APAP intestinal/hepática 2-OC no meio em condições estáticas e dinâmicas. *P<0,05 condições estáticas versus dinâmicas. (F) Comparação entre o perfil de concentração-tempo da APAP em nosso sistema microfisiológico (curva vermelha e eixo y) e um perfil representativo obtido em humanos após uma única dose oral de 1000 mgs (curva preta e eixo y). Os dados foram extraídos de parcelas usando o WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sistema HPLC Waters Alliance 2695 (Milford, MA, EUA), equipado com bomba quaternária, gerente de amostras e degasser
Detector Waters 2996 Uv-Vis definido em 210-400 nm de alcance
Controle do sistema, aquisição de dados e processamento Waters Empower 2002 software de cromatografia
Coluna Fase invertida Luna C18
(150 x 4,6 mm I.D.; tamanho de partícula de 5mm)
Phenomenex
Coluna de Guarda Fase invertida Luna C18 (4 x 3 mm)
Phenomenex
Fase móvel Solvente A-Acetonitrila
Solvente B- 0,10 M acetato de amônio, pH 6.8
Condições isocráticas Hora A (%) B (%)
(min.)
15 5 95
Fluxo 1,0 mL/min
Volume de injeção 25 μL
Temperatura 25 °C
Detecção de APAP UV @ 243 e 254 nm
Tempo de execução 15 minutos

Tabela 1: Condições e parâmetros a serem utilizados para análises HPLC-UV da APAP em matrizes médias de cultura.

Concentração nominal Concentração de APAP calculado (μM) Média (μM) S.D. C.v. Dev
(μM) (Triplicado de cada concentração) (μM) (%)c (%)d
Número de ensaio 1 2 3 4 5 6
0.25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46,05
0,50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0.09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0.03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tabela 2: Variação de execução inter- precisão, precisão e linearidade das amostras de curva padrão preparadas em uma mistura de meio DMEM com tampão de acetato de amônio de 0,10 M (1:1, v/v) de seis ensaios separados. um
um Uma curva linear foi encaixada aos dados para uma resposta (APAP) versus concentração teórica, conforme descrito em Experimental. A concentração calculada foi derivada da leitura da resposta para cada amostra padrão contra a curva de calibração. Cada entrada (ensaio 1-6) corresponde ao valor médio da análise triplicada.
b SD= Desvio padrão.
c C.V. (coeficiente de variação. precisão).
d Precisão (DEV %) = o desvio da concentração calculada do valor nominal.
Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Concentração nominal Concentração de APAP calculado (μM) Média S.D. C.v. Dev
(μM) (Triplicado de cada concentração) (μM) (μM) (%)c (%)d
Número de ensaio 1 2 3 4 5
0.25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26.03
0,50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14,97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6,85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1,56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0.01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0,05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tabela 3: Variação inter-executada – precisão, precisão e linearidade das amostras de curva padrão preparadas em uma mistura de meio Williams com tampão de acetato de amônio de 0,10 M (1:1, v/v) de seis ensaios separados. um
um Uma curva linear foi encaixada aos dados para uma resposta (APAP) versus concentração teórica, conforme descrito em Experimental. A concentração calculada foi derivada da leitura da resposta para cada amostra padrão contra uma curva de calibração. Cada entrada (ensaio 1-5) corresponde ao valor médio da análise triplicada.
b SD= Desvio padrão.
c C.V. (coeficiente de variação. precisão).
d Precisão (DEV %) = o desvio da concentração calculada do valor nominal.
Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Meio Williams Concentração nominal Concentração medida S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-run (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1,77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8.37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8,57
Inter-run (n=15) 0,50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14,97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2,99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5,88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5.31
Meio DMEM Concentração nominal Concentração medida S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-run (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6.35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1,69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4.00
Inter-run (n=12) 0,50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7,75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tabela 4: Precisão e precisão intra e inter-executado para APAP em amostras de controle de qualidade. um
um Os dados são mostrados como médias. SD (desvio padrão). C.V. (coeficiente de variação. precisão) e precisão (desvio percentual. DEV%).
Este número foi modificado de Marin et al. Absorção de acetaminofeno e metabolismo em um sistema microfisiológico intestinal/hepático. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Primer (5' → 3')
Tecido Gene Frente Reverter
Intestino SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgAgACggt
NA-K-ATPase ACCgCCCAgAAATCAAAAACACACAAC CAgCggTCATCCCAgTCC
MDR1 TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTTgg
Fígado Albumina TgCAAggCTgATAAggAg TTTAgAGAGGGTTTTGGCTTTACAC
GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgC AgCAgAgggaaggCtggaaAATAAg
CPY3A4 ggAAggTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgTgAAggCTggAg

Tabela 5: Primers qPCR em tempo real para avaliar a transcrição genética no nível mRNA nas culturas 2-OC para tecidos intestinais e hepáticos

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Discussion

A avaliação precisa e confiável das propriedades farmacológicas de novas drogas investigativas é fundamental para reduzir o risco nas seguintes etapas de desenvolvimento. O MPS é uma tecnologia relativamente nova, que visa melhorar o poder preditivo e reduzir os custos e o tempo gasto com testes pré-clínicos. Nosso grupo está avançando na avaliação de propriedades farmacocinéticas e toxicológicas, principalmente necessárias para otimização de chumbo. Trabalhamos com o dispositivo microfluido 2-OC, que possui duas câmaras, permitindo a integração de dois organoides. A APAP foi escolhida porque possui muitos dados humanos de alta qualidade, é principalmente metabolizada pelo fígado, e também exibe propriedades hepatotóxicas. O protocolo de estudo teve como objetivo emular algumas etapas do ensaio clínico da fase I humana, onde uma droga é administrada oralmente aos voluntários, e amostras periódicas de sangue são coletadas para avaliar a concentração dos medicamentos para conhecer as propriedades farmacocinéticas e parâmetros bioquímicos e clínicos para avaliar a segurança e a tolerabilidade. Portanto, quando o MPS evoluir o suficiente para fornecer previsões confiáveis, reduzirá significativamente o risco de falha no ensaio da fase I. Adicionando os modelos da doença no futuro, a mesma suposição possivelmente se aplicará às fases II e III dos ensaios clínicos.

Todos os estudos foram realizados em três modelos: Intestino 2-OC (Administração Oral APAP), Fígado 2-OC (Administração Intravenosa) e Intestino/Fígado 2-OC (administração oral). O primeiro modelo isolou a absorção, o segundo o metabolismo, e o terceiro integrou ambos. Primeiro produzimos os organoides e incorporamos no dispositivo microfluido, primeiro administramos o APAP e coletamos as amostras de mídia, e pela última vez realizamos um conjunto de testes para avaliar a viabilidade e funcionalidade celular e o impacto toxicológico da exposição à APAP. Para os estudos farmacocinéticos, desenvolvemos e validamos um método cromatográfico para quantificação apap no meio. A validação cumpriu a Diretriz de Validação do Método Bioanlítico quanto à especificidade, linearidade, limite de quantificação (LOQ), limite de detecção (LOD), efeito matricial, precisão e precisão, conforme descrito pela FDA29,30. A especificidade foi estabelecida com amostras biológicas em branco, agrupadas e individuais de duas fontes diferentes. O método foi realizado de forma aceitável durante a análise, e os dados confirmaram a capacidade de uma simples fase móvel isocrática de separar e quantificar a APAP.

A viabilidade/funcionalidade do intestino e organoides hepáticos foi avaliada por diferentes técnicas. Para o equivalente ao intestino, a microscopia de fluorescência confocal (Figura 2A-B),o ensaio MTT(Figura 2C),a avaliação da expressão genética(Figura 2D-F) ou o experimento HCA, não detectou nenhuma toxicidade 24 h após a exposição ao APAP. Da mesma forma, o ensaio MTT não detectou insultos tóxicos induzidos pela APAP em equivalentes hepáticos(Figura 3A). No entanto, a técnica do HCA adicionou a possibilidade de detecção de eventos tóxicos muito precoces (24 h após a exposição apap) para células hepáticas, pela observação de alterações fenotípicas celulares, com algumas pistas mecanicistas(Figura 3D). Por outro lado, a microscopia de fluorescência confocal (Figura 3B) e a histologia(Figura 3C) mostraram-se uma ferramenta complementar útil na investigação do estado de viabilidade dos equivalentes do tecido humano. Para as células hepáticas, o uso simultâneo de diferentes técnicas foi muito vantajoso. O ensaio MTT, como mencionado anteriormente, não foi capaz de detectar a citotoxicidade APAP detectada pelo HCA 24 h após a exposição apap. As análises de expressão genética avaliaram a funcionalidade do intestino (Figura 2D-F) e organoides hepáticos(Figura 4A-D) tanto em basal quanto 24 horas após o tratamento APAP. Em condições basais, havia níveis normais de marcadores intestinais e hepáticos específicos, sugerindo funcionalidade adequada. Após 24 horas de exposição apap, houve uma redução da albumina, níveis de mRNA GST, e uma tendência a reduzir a expressão genética CYP3A4 em tecidos equivalentes hepáticos, indicando citotoxicidade precoce apap. Corroborando esses achados, os experimentos de manchas ocidentais mostraram que a redução da expressão genética também foi acompanhada por uma redução robusta na expressão proteica de albumina total do fígado em resposta ao tratamento APAP(Figura 4E-F),confirmando os insultos tóxicos impostos ao tecido hepático pela exposição à APAP. Assim, os experimentos de atividade enzimática in vitro mostraram uma redução robusta e progressiva nos níveis de atividade CYP 3A4 induzidos pelo tratamento APAP, em equivalentes hepáticos(Figura 4H-I).

As estatísticas morfométricas dos organoides foram realizadas na Imagem J (Figura 3E-I). A área revela o quão próximo o tamanho 2D está de todos os organoides analisados, que poderiam ser usados como padronização neste protocolo para que um resultado imparcial possa ser produzido. Os "descritores de forma" revelam estatísticas correspondentes precisamente à morfologia da forma. A Proporção é um índice que utiliza o eixo maior e menor, de modo que os resultados em torno de 1 não indicam viés (ou seja, crescimento preferencial) durante a formação organoide. Os valores de Arredondamento (4 ×[área]/ (π × [eixo principal]2)) são muito sensíveis a um crescimento preferencial, que seria revelado como um eixo importante. A solidez ([área]/ ([área convexa]) é essencial para mostrar morfologia bruta, pois não é afetada por irregularidades nas fronteiras, uma vez que utiliza área convexa (=envelope). Distribuições centradas em torno de 1.0 indicam crescimento esférico putativo. Por outro lado, a circularidade (4× π [área]/[perímetro]2) é muito sensível a um perímetro complexo, de modo que "cavidades" ou "bolsos" impactariam esse índice. Assim, a circularidade em torno de 1 também corrobora o crescimento esférico putativo, compatível com a funcionalidade organoide adequada.

Os resultados analíticos mostraram que o MPS poderia emular as propriedades de absorção e metabolismo apap, isoladas ou integradas em uma curva comparável à produzida in vivo (Figura 5F) sem a fase de excreção. A absorção apap foi semelhante após a administração oral tanto para os modelos de MPS intestinal quanto intestinal/fígado, em condições estáticas e dinâmicas(Figura 5A-B, Figura 5D-E). Em ambos, houve diminuição da concentração de APAP no lado apical concomitantemente ao seu aumento no lado basolateral, sem diferença significativa para condições estáticas e dinâmicas. Em contraste, o metabolismo hepático APAP diferia nessas condições. A mídia circulante em MPS parecia melhorar a capacidade metabólica organoide(Figura 5C e Figura 5E). Houve um fluxo de decadência APAP significativo não visto sem fluxo. Curiosamente, experimentos de atividade in vitro, CYP3A4 corroboram a hipótese de que a presença de fluxo no sistema aumenta a funcionalidade dos equivalentes hepáticos humanos. Como mostrado no gráfico da Figura 4J,a atividade do CYP 3A4 foi significativamente maior em equivalentes hepáticos mantidos sob fluxo em condições de tratamento basais e APAP. Da mesma forma, os equivalentes hepáticos mantidos sob fluxo (dinâmico) mostraram tendência a aumentar a expressão proteica da albumina quando comparados àqueles mantidos sem fluxo (estático) tanto na linha de base quanto nas condições tratadas apap(Figura 4G).

Quando comparado com o perfil de tempo de concentração após a administração oral do APAP para humanos, nosso sistema microfisiológico mostra muito maior t1/2 (tempo de meia-vida) (Figura 5F). Isso acontece, como mencionado anteriormente, porque enquanto temos um sistema de dois órgãos com equivalentes de intestino e fígado que podem absorver e metabolizar a droga, não há equivalente renal para excretar APAP e seus metabólitos do compartimento de plasma38. Além disso, o sistema microfisiológico apresenta menor Cmax (concentração de plasma de pico) e tmax maior (tempo para chegar a Cmax) do que o normalmente observado para humanos(Figura 5F). Isso é consequência das diferenças na escala dos experimentos in vitro e in vivo. No geral, há três principais diferenças entre o perfil de concentração-tempo obtido utilizando o sistema microfisiológico e os perfis obtidos após a administração oral da APAP para humanos: maior t1/2, menor Cmax e tmax maior(Figura 5F). Enquanto o t1/2 maior é devido à ausência de um rim equivalente a excretar APAP e seus metabólitos do equivalente plasmático, menores Cmax e tmax maior são consequências da pequena escala do experimento quando comparado com o corpo humano. As melhores estratégias de dimensionamento para construção e operação de sistemas microfisiológicos ainda são uma área ativa de pesquisa e é improvável que uma única abordagem seja ideal para todos os sistemas39. Além disso, a modelagem matemática ou aprendizado de máquina pode ser usada para aplicar correções ou aprender o mapeamento da micro escala em escala completa, a fim de extrapolar dados in vitro obtidos com os sistemas microfisiológicos ao comportamento in vivo observado em humanos40.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Christie Guguen-Guillouzo, ao Dr. Philippe Gripon na Unidade 522 INSERM e ao Dr. Christian Trepo na Unidade 271 INSERM pelo uso do Material Biológico (células Hepa RG) e por disponibilizar para nós, a fim de realizar a pesquisa acadêmica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

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Química Edição 166 Sistema Microfisiológico Acetaminofeno ADMETox Organoides
Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas
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