Et mikrofysiologisk system for lægemiddelmakokinetisk og toksikologisk vurdering af tarmen/leversystemet
Summary
Vi udsatte et mikrofysiologisk system (MPS) med tarm og leverorganoider for acetaminophen (APAP). I denne artikel beskrives metoderne til organoidproduktion og APAP-farmakoketiske og toksikologiske ejendomsvurderinger i mps.’ en. Den beskriver også de vævsfunktionsanalyser, der er nødvendige for at validere resultaterne.
Abstract
De nyligt indførte mikrofysiologiske systemer (MPS), der dyrker humane organoider, forventes at klare sig bedre end dyr i den prækliniske testfase af lægemiddeludviklingsprocessen, fordi de er genetisk menneskelige og opsummerer samspillet mellem væv. I denne undersøgelse den menneskelige tarmbarriere (emuleret af en samkultur af Caco-2 og HT-29 celler) og leverækvivalenten (emuleret af sfæroider lavet af differentierede HepaRG-celler og humane levertenytceller) blev integreret i en mikrofluidisk anordning med to orgelchip (2-OC) til vurdering af nogle acetaminophofen (APAP) farmakologiske (PK) og toksikologiske egenskaber. MPS havde tre forsamlinger: Tarm kun 2-OC, Lever kun 2-OC, og tarm /lever 2-OC med de samme medier perfusing begge organoider. Til PK-vurderinger udførte vi APAP i medierne på forudindstillede tidspunkter efter administration af den enten over tarmbarrieren (efterligner den mundtlige rute) eller i medierne (efterligner den intravenøse rute) ved henholdsvis 12 μM og 2 μM. Medieprøverne blev analyseret ved omvendt fase højtryksvæskekromatografi (HPLC). Organoider blev analyseret for genekspression, for TEER værdier, for proteinudtryk og aktivitet, og derefter indsamlet, fast, og sendt til et sæt af morfologiske evalueringer. MTT-teknikken klarede sig godt ved vurderingen af organoidens levedygtighed, men analyserne med højt indhold (HCA) var i stand til at påvise meget tidlige toksiske hændelser som reaktion på APAP-behandling. Vi har kontrolleret, at mediestrømmen ikke i væsentlig grad påvirker APAP-absorptionen, mens det forbedrer leverens tilsvarende funktionalitet betydeligt. APAP menneskelige intestinal absorption og levermetabolisme kunne efterlignes i MPS. Forbindelsen mellem MPS-data og silicomodellering har et stort potentiale til at forbedre forudsigeligheden af in vitro-metoderne og give bedre nøjagtighed end dyremodeller i farmakokologiske og toksikologiske undersøgelser.
Introduction
På grund af genomiske og proteomiske forskelle har dyremodeller begrænset prædiktiv værdi for flere menneskelige resultater. Desuden er de tidskrævende, dyre og etisk tvivlsomme1. MPS er en forholdsvis ny teknologi, der har til formål at forbedre den prædiktive effekt og reducere omkostninger og tid brugt med prækliniske tests. De er mikrofluidiske anordninger, der dyrker organoider (kunstige mimetik funktionelle enheder af organer) under medieflow, der fremmer organoid-organoid kommunikation. Organoider fremstillet af humane celler øger den translationellerelevans 2,3,4. MPS forventes at klare sig bedre end dyreforsøgene, fordi de er genetisk menneskelige og opsummere samspillet mellem væv. Når den er fuldt funktionsdygtig, vil mps give mere meningsfulde resultater, ved højere hastighed og lavere omkostninger og risici4. Mange grupper er ved at udvikle MPS til flere formål, især sygdomsmodeller til test af lægemidlets effektivitet.
Eksponeringsniveau er en af de mest kritiske parametre til vurdering af lægemidlets effekt ogtoksicitet 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS tillader organoid integration, der emulerer systemisk eksponering og forventes at klare sig bedre end den traditionelle 2D humane væv kultur. Denne teknologi kan forbedre forudsigelsen af sammensat tarmabsorption og levermetabolisme4betydeligt.
En MPS integrere menneskelige ækvivalent model af tarm og lever er et godt udgangspunkt, i betragtning af den centrale rolle, som disse to organer i narkotika biotilgængelighed og systemiskeksponering 13,14,15. APAP er et attraktivt lægemiddel til at studere en MPS uden en nyre tilsvarende, fordi dens metabolisering sker primært af leveren16,17.
Den 2-OC er en to-kammer mikrofluidisk enhed egnet til kulturen i to forskellige humane ækvivalente væv / organoider forbundet med mikrokanaler16. For at efterligne en in vitro human oral/intravenøs administration af et lægemiddel og vurdere virkningerne af krydstale mellem tarmen og leverækvivalenter på APAP farmakokinetik, ud over organoidernes funktionalitet og levedygtighed blev der udført tre forskellige MPS-samlinger: 1) en “Tarm 2-OC MPS” bestående af en tarmækvivalent baseret i et kulturindsættelse, der indeholder en Caco-2 + HT-29-cellers cokultur, integreret i 2-OC-enheden; 2) en “Lever 2-OC MPS” bestående af lever sfæroider af HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) integreret i 2-OC enhed; og (3) en “Tarm/lever 2-OC MPS” bestående af tarmækvivalenten i det ene enhedsrum, der kommunikerer med leverækvivalenten i den anden af mediestrømmen gennem de mikrofluidiske kanaler.
Alle analyser blev udført under statiske (ingen flow) og dynamiske (med flow) forhold på grund af virkningen af den mekaniske stimuli (kompression, stretching, og forskydning) på cellens levedygtighed og funktionaliteter18,19,20. I denne artikel beskrives protokollen for APAP oral/intravenøs indhyling emulering og de respektive absorption / metabolisme og toksikologiske analyser i 2-OC MPS indeholder human tarm og lever ækvivalent modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nøjagtige og pålidelige vurdering af de farmakologiske egenskaber ved efterforskningsmæssige nye lægemidler er afgørende for at reducere risikoen i de følgende udviklingstrin. Mps er en forholdsvis ny teknologi, der har til formål at forbedre den prædiktive effekt og reducere omkostninger og tid brugt med prækliniske tests. Vores gruppe er fremme i vurderingen af farmakokoptiske og toksikologiske egenskaber for det meste er nødvendige for bly optimering. Vi arbejdede med 2-OC microfluidic enhed, som har to …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon på Unit 522 INSERM og dr. Christian Trepo på Unit 271 INSERM for brugen af det biologiske materiale (Hepa RG celler) og for at stille derefter til rådighed for os for at udføre den akademiske forskning.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
References
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
- Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 – Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 – Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 – In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
- OECD. OECD TG 439 – In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
