Ein Mikrophysiologisches System für die pharmakokinetische und toxikologische Beurteilung von Arzneimitteln/Leber
Summary
Wir haben ein mikrophysiologisches System (MPS) mit Darm- und Leberorganoiden Acetaminophen (APAP) ausgesetzt. Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Organoidproduktion und APAP pharmakokinetische und toxikologische Eigenschaftenbewertungen im MPS. Es beschreibt auch die Gewebefunktionsanalysen, die notwendig sind, um die Ergebnisse zu validieren.
Abstract
Die kürzlich eingeführten mikrophysiologischen Systeme (MPS), die humane Organoide kultivieren, sollen in der präklinischen Testphase des Arzneimittelentwicklungsprozesses besser abschneiden als Tiere, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. In dieser Studie wurden die menschliche Darmbarriere (emuliert durch eine Kokultur von Caco-2- und HT-29-Zellen) und das Leberäquivalent (emuliert durch Sphäroide aus differenzierten HepaRG-Zellen und humanen Hepatic Stellate-Zellen) in einen Zwei-Organ-Chip (2-OC) mikrofluidischen Gerät integriert, um einige Acetaminophen (APAP) pharmakokinetische (PK) und toxische Eigenschaften zu bewerten. Die MPS hatte drei Baugruppen: Darm nur 2-OC, Leber nur 2-OC, und Darm/Leber 2-OC mit dem gleichen Medium durchdringen beide Organoide. Für PK-Bewertungen dosierten wir das APAP in den Medien zu voreingestellten Zeitpunkten, nachdem wir es entweder über die Darmbarriere (Emulierung des oralen Weges) oder in den Medien (Emulierung des intravenösen Weges) verabreicht hatten, auf 12 m bzw. 2 m. Die Medienproben wurden mittels umgekehrter Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Organoide wurden auf Genexpression, für TEER-Werte, auf Proteinexpression und -aktivität analysiert und dann gesammelt, fixiert und einer Reihe morphologischer Auswertungen unterzogen. Die MTT-Technik schnitt bei der Beurteilung der Organoid-Lebensfähigkeit gut ab, aber die Hochgehaltsanalysen (HCA) konnten sehr frühe toxische Ereignisse als Reaktion auf die APAP-Behandlung erkennen. Wir haben überprüft, dass der Medienfluss die APAP-Absorption nicht signifikant beeinflusst, während er die Leberäquivalentfunktionalität erheblich verbessert. Die aPAP menschliche Darmabsorption und Leberstoffwechsel könnte im MPS emuliert werden. Die Verbindung zwischen MPS-Daten und der Silico-Modellierung hat ein großes Potenzial, die Vorhersehbarkeit der In-vitro-Methoden zu verbessern und eine bessere Genauigkeit als Tiermodelle in pharmakokinetischen und toxikologischen Studien zu bieten.
Introduction
Aufgrund genomischer und proteomischer Unterschiede haben Tiermodelle einen begrenzten Vorhersagewert für mehrere menschliche Ergebnisse. Darüber hinaus sind sie zeitaufwändig, teuer und ethisch fragwürdig1. MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und zeitaufwand für präklinische Tests zu reduzieren. Sie sind mikrofluidische Geräte, die Organoide (künstliche Mimetik-Funktionseinheiten von Organen) unter Medienfluss kultivieren, die organoid-organoide Kommunikation fördert. Organoide aus menschlichen Zellen erhöhen die translationale Relevanz2,3,4. Es wird erwartet, dass MPS besser abschneidet als die Tierversuche, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. Wenn das MPS voll funktionsfähig ist, liefert es aussagekräftigere Ergebnisse bei höherer Geschwindigkeit und niedrigeren Kosten und Risiken4. Viele Gruppen entwickeln MPS für mehrere Zwecke, vor allem Krankheitsmodelle, um die Wirksamkeit des Medikaments zu testen.
Expositionsniveau ist einer der kritischsten Parameter für die Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln5,6,7,8,9,10,11,12. MPS ermöglicht eine organoide Integration, die eine systemische Exposition emuliert und eine bessere Leistung als die traditionelle 2D-Gewebekultur erwartet. Diese Technologie kann die Vorhersage der zusammengesetzten Darmabsorption und Desleberstoffwechsel deutlich verbessern4.
Ein MPS, das menschlicheäquivalente Modell von Darm und Leber integriert, ist ein guter Ausgangspunkt, wenn man die zentrale Rolle dieser beiden Organe bei der Bioverfügbarkeit von Medikamenten und der systemischen Exposition13,14,15betrachtet. APAP ist ein attraktives Medikament für das Studium eines MPS ohne Nierenäquivalent, weil seine Metabolisierung vor allem von der Leber16,17erfolgt.
Das 2-OC ist ein zweikammeriges mikrofluidisches Gerät, das für die Kultur von zwei verschiedenen menschlichen Äquivalentgeweben/Organoiden geeignet ist, die durch Mikrokanäle16miteinander verbunden sind. Um eine orale/intravenöse Verabreichung eines Arzneimittels beim Menschen in vitro zu emulieren und die Auswirkungen des Kreuzgesprächs zwischen Darm- und Leberäquivalenten auf die APAP-Pharmakokinetik zu bewerten, wurden neben der Funktionalität und Lebensfähigkeit der Organoide drei verschiedene MPS-Baugruppen durchgeführt: (1) ein “Darm 2-OC MPS”, das aus einem Darmäquivalent besteht, das in einem Kultureinsatz basiert, der eine Kokultur von Caco-2 + HT-29-Zellen enthält; (2) ein “Liver 2-OC MPS” bestehend aus Lebersphäroiden aus HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells), die in das 2-OC-Gerät integriert sind; und (3) ein “Darm/Leber 2-OC MPS” bestehend aus dem Darmäquivalent in einem Gerätefach, das durch den Medienfluss durch die mikrofluidischen Kanäle mit dem Leberäquivalent im anderen kommuniziert.
Alle Assays wurden unter statischen (keinen Durchfluss) und dynamischen (mit Strömung) Bedingungen aufgrund der Auswirkungen der mechanischen Reize (Kompression, Dehnung und Scherung) auf die Zelllebensfähigkeit und Funktionalitäten18,19,20durchgeführt. Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll für die APAP-Oral-/Intravenous-Verabreichungsemulation und die jeweiligen Absorptions-/Stoffwechsel- und toxikologischen Analysen in der 2-OC-MPS, die menschliche Darm- und Leberäquivalentmodelle enthält.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die genaue und zuverlässige Bewertung der pharmakologischen Eigenschaften von investigativen neuen Arzneimitteln ist entscheidend für die Verringerung des Risikos in den folgenden Entwicklungsschritten. Die MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und Zeit zu reduzieren, die mit präklinischen Tests verbracht werden. Unsere Gruppe schreitet bei der Bewertung pharmakokinetischer und toxikologischer Eigenschaften voran, die hauptsächlich für die Blei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon am Referat 522 INSERM und Dr. Christian Trepo am Referat 271 INSERM für den Einsatz des Biologischen Materials (Hepa RG Zellen) und für die bereitstellung für uns, um die akademische Forschung durchzuführen.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
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