Et mikrofysiologisk system for farmakokinetisk og toksikologisk vurdering av tarmen/leveren
Summary
Vi eksponerte et mikrofysiologisk system (MPS) med tarm- og leverorganoider for paracetamol (APAP). Denne artikkelen beskriver metodene for organoid produksjon og APAP farmakokinetiske og toksikologiske eiendomsvurderinger i MPS. Den beskriver også vevfunksjonsanalysene som er nødvendige for å validere resultatene.
Abstract
De nylig introduserte mikrofysiologiske systemene (MPS) som dyrker menneskelige organoider forventes å yte bedre enn dyr i den prekliniske testfasen av stoffutviklingsprosessen fordi de er genetisk menneskelige og rekapulerer samspillet mellom vev. I denne studien ble den menneskelige tarmbarrieren (emulert av en co-kultur av Caco-2 og HT-29 celler) og leverekvivalenten (emulert av sfæroider laget av differensierte HepaRG-celler og humane hepatiske stellateceller) integrert i en toorganchip (2-OC) mikrofluidisk enhet for å vurdere noen paracetamol (APAP) farmakokinetiske (PK) og toksikologiske egenskaper. MPS hadde tre forsamlinger: Tarmen bare 2-OC, Liver bare 2-OC, og Tarm / Lever 2-OC med samme media perfusing begge organoider. For PK-vurderinger doserte vi APAP i media ved forhåndsinnstilte tidspunkter etter administrering av det enten over tarmbarrieren (emulering av den orale ruten) eller i media (emulerer intravenøs rute), ved henholdsvis 12 μM og 2 μM. Medieprøvene ble analysert av omvendt fase høytrykks flytende kromatografi (HPLC). Organoider ble analysert for genuttrykk, for TEER-verdier, for proteinuttrykk og aktivitet, og deretter samlet inn, fast og sendt til et sett med morfologiske evalueringer. MTT-teknikken gjorde det bra i vurderingen av organoid levedyktighet, men de høye innholdsanalysene (HCA) var i stand til å oppdage svært tidlige toksiske hendelser som svar på APAP-behandling. Vi bekreftet at mediestrømmen ikke påvirker APAP-absorpsjonen betydelig, mens den forbedrer leverekvivalentfunksjonaliteten betydelig. APAP menneskelig intestinal absorpsjon og levermetabolisme kan emuleres i MPS. Sammenhengen mellom MPS-data og silicomodellering har stort potensial til å forbedre forutsigbarheten til in vitro-metodene og gi bedre nøyaktighet enn dyremodeller i farmakokinetiske og toksikologiske studier.
Introduction
På grunn av genomiske og proteomiske forskjeller har dyremodeller begrenset prediktiv verdi for flere menneskelige resultater. Videre er de tidkrevende, dyre og etisk tvilsomme1. MPS er en relativt ny teknologi som tar sikte på å forbedre den prediktive kraften og redusere kostnadene og tiden som brukes med prekliniske tester. De er mikrofluidiske enheter som dyrker organoider (kunstige mimetika funksjonelle enheter av organer) under mediestrømmen som fremmer organoid-organoid kommunikasjon. Organoider laget av menneskelige celler øker translasjonellrelevans 2,3,4. MPS forventes å yte bedre enn dyretestene fordi de er genetisk menneskelige og rekafulerer samspillet mellom vev. Når det er fullt funksjonelt, vil MPS gi mer meningsfulle resultater, med høyere hastighet og lavere kostnader og risiko4. Mange grupper utvikler MPS for flere formål, spesielt sykdomsmodeller for å teste stoffets effekt.
Eksponeringsnivå er en av de mest kritiske parametrene for evaluering av legemiddeleffektivitet ogtoksisitet 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS tillater organoid integrasjon som emulerer systemisk eksponering og forventes å yte bedre enn den tradisjonelle 2D menneskelige vevskulturen. Denne teknologien kan forbedre prediksjonen av sammensatt tarmabsorpsjon og levermetabolisme4.
En MPS integrere menneskelig ekvivalent modell av tarm og lever er et godt utgangspunkt, vurderer den sentrale rollen til disse to organene i narkotika biotilgjengelighet og systemisk eksponering13,14,15. APAP er et attraktivt stoff for å studere en MPS uten nyreekvivalent fordi metaboliseringen gjøres hovedsakelig avleveren 16,17.
2-OC er en to-kammers mikrofluidisk enhet egnet for kulturen til to forskjellige menneskelige ekvivalente vev / organoider forbundet med mikrokanaler16. For å etterligne en in vitro human oral/intravenøs administrering av et legemiddel og vurdere effekten av kryss-snakk mellom tarmen og leverekvivalenter på farmakokinetikken til APAP, i tillegg til organoider funksjonalitet og levedyktighet, tre forskjellige MPS-samlinger ble utført: (1) en “Tarm 2-OC MPS” består av en tarm tilsvarende basert i en kultur innsats som inneholder en Caco-2 + HT-29 celler kokultur, integrert i 2-OC enhet; (2) en “Liver 2-OC MPS” bestående av leversfæroider laget av HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) integrert i 2-OC-enheten; og (3) en “Tarm/Lever 2-OC MPS” bestående av tarmen tilsvarende i ett enhetsrom kommunisere med leveren tilsvarende i den andre av media flyter gjennom mikrofluidiske kanaler.
Alle analyser ble utført under statiske (ingen flyt) og dynamiske (med strømning) forhold på grunn av virkningen av de mekaniske stimuli (kompresjon, strekking og skjær) på celle levedyktighet og funksjonalitet18,19,20. Den nåværende artikkelen beskriver protokollen for APAP oral/intravenøs administrasjon emulering og de respektive absorpsjon /metabolisme og toksikologiske analyser i 2-OC MPS som inneholder humant tarm og leverekvivalente modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nøyaktige og pålitelige vurderingen av de farmakologiske egenskapene til undersøkende nye legemidler er avgjørende for å redusere risikoen i følgende utviklingstrinn. MPS er en relativt ny teknologi, som tar sikte på å forbedre den prediktive kraften og redusere kostnadene og tiden som brukes med prekliniske tester. Vår gruppe er fremme i vurderingen av farmakokinetiske og toksikologiske egenskaper hovedsakelig nødvendig for bly optimalisering. Vi jobbet med 2-OC mikrofluidisk enhet, som har to kamre, slik …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon på Unit 522 INSERM og dr. Christian Trepo ved Unit 271 INSERM for bruk av biologisk materiale (Hepa RG celler) og for å gjøre da tilgjengelig for oss for å utføre den akademiske forskningen.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
References
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
- Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
- Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
- Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
- Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
- Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
- Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
- Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
- Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
- Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
- Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
- Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
- Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
- Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
- Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
- Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- OECD. OECD TG 491 – Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
- Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
- OECD. OECD TG 492 – Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
- OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 – In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
- OECD. OECD TG 439 – In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
- Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
- Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
- Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).
