إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف
Summary
هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإنتاج والخلفية CRISPR/كاس 9 الجينوم الأسماك الكهربائية ضربه قاضيه. المبينة بالتفصيل هي البيولوجيا الجزيئية المطلوبة ، وتربيه ، ومتطلبات تربيه لكل من عاريه القدمين والفطريات ، وتقنيات الحقن لإنتاج كاس 9 المستحثة اليرقات F0 .
Abstract
وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. هناك درجه مذهله من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المشتقة بشكل مستقل ، والتي تشترك في الهندسة الوراثية المشتركة. ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست التوثيق التي تنتج والكشف عن المجالات الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية ضئيله. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء للشعور محيطها والتواصل ، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية والنظم والدوائر علم الأعصاب ، فسيولوجيا الخلوية ، والإيكولوجيا ، والبيولوجيا التطورية ، والسلوك. وفي الاونه الاخيره ، كان هناك تكاثر في الموارد الجينية للأسماك الكهربائية. وقد يسر استخدام هذه الموارد بالفعل رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية. نحن الإبلاغ هنا بروتوكول كامل لأداء CRISPR/كاس 9 الطفرات التي تستخدم أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية في الأسماك الكهربائية ضعيف. ونحن نثبت ان هذا البروتوكول هو نفس القدر من الفعالية في كل من الأنواع القنوميه بالضغط البري والضرب بالضغط العضلي الخاص gauderio باستخدام crispr/كاس 9 لاستهداف indels ونقطه الطفرات في اكسون الأول من قناه الصوديوم الجينات scn4aa. باستخدام هذا البروتوكول ، تم الحصول علي الاجنه من كلا النوعين والتنميط الجيني للتاكد من ان الطفرات المتوقعة في أول اكسون من قناه الصوديوم scn4aa كانت موجودة. تم تاكيد النمط الظاهري نجاح ضربه الخروج مع التسجيلات التي تظهر انخفاض الجهاز الكهربائية التفريغ السعه بالمقارنة مع الضوابط المتطابقة حجم غير المحقونة.
Introduction
وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. اثنين من السلالات من الأسماك تيليوست ، العظم العظمي و siluriformes ، تطورت الكهربي في موازاة ذلك ، وخمسه السلالات من تيليوستس (جينوتيفورسيس ، mormyrids ، والأجناس astroscopus، مالتراوروس ، والزليلي) تطورت الكهربية بالتوازي. هناك درجه ضرب من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المستمدة بشكل مستقل ، والتي تشترك في العمارة الوراثية المشتركة1،2،3.
ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست clades ، والتي تنتج والكشف عن الحقول الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية بشكل ضعيف. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء لاستشعار محيطها والتواصل4، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية1،5 ،6، نظم ودوائر علم الأعصاب7،8،9،10، فسيولوجيا الخلوية11،12، الإيكولوجيا و تصغر13 ،14،15،16،17، السلوك18،19، و ماكروايفوليوشن3،20،21 .
في الاونه الاخيره ، كان هناك انتشار الجينوم ، الناسخ ، والموارد البروتينية للأسماك الكهربائية1،22،23،24،25،26، 27و28. وقد أسفر استخدام هذه الموارد بالفعل عن رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع1و2و3و28و29 ،30. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية31.
واحده من هذه الاداات هي التي تم تطويرها مؤخرا متفاوت المسافات المتقاربة بانتظام المتناظرة القصيرة التكرارات المقترنة مع كاس 9 نوكليوداز (CRISPR/كاس 9 ، CRISPR) تقنيه. Crispr/كاس 9 هو أداه تحرير الجينوم التي دخلت استخداما واسع النطاق في كل من نموذج32،33،34 وغير الكائنات النموذجية35،36،37 علي حد سواء. وقد تقدمت تكنولوجيا CRISPR/كاس 9 إلى نقطه حيث يمكن للمختبر قادر علي البيولوجيا الجزيئية الاساسيه بسهوله توليد تحقيقات الجينات الخاصة تسمي الإرشاد القصير RNAs (sgRNAs) ، بتكلفه منخفضه باستخدام طريقه عدم الاستنساخ38. Crispr لديه مزايا علي غيرها من الضربات القاضية/الضربة القاضية استراتيجيات, مثل مورفولينوس39,40, النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب (talens), والزنك الاصبع نوكليسيس (zfns), التي هي مكلفه و تستغرق وقتا طويلا لتوليد كل الجينات المستهدفة.
وظائف نظام CRISPR/كاس 9 لخلق الضربات القاضية الجينات من خلال استهداف منطقه معينه من الجينوم ، من إخراج تسلسل sgRNA ، وتسبب كسر التي تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم الكشف عن الكسر المزدوج الذي تقطعت به السبل من قبل الخلية ويحفز أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية بتفضيل باستخدام المسار غير المتماثلة نهاية الانضمام (NHEJ). هذا المسار هو عرضه للخطا للغاية: خلال عمليه الإصلاح ، وجزيء الحمض النووي وغالبا ما تدمج الادراج أو الحذف (indels) في موقع كسر التي تقطعت بها السبل مزدوجة. هذه العوامل يمكن ان يؤدي إلى فقدان وظيفة بسبب اما (1) التحولات في اطار القراءة المفتوحة ، (2) ادراج codon توقف سابق لأوانه ، أو (3) التحولات في البنية الاساسيه الحرجة من المنتج الجيني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم CRISPR/كاس 9 التحرير إلى الطفرات نقطه الهدف في الجينات المستهدفة باستخدام NHEJ في أنواع الأسماك الكهربائية ضعيفه. في حين ابسط وأكثر كفاءه من التقنيات الأخرى ، ومن المتوقع ان يؤدي هذا الأسلوب من الطفرات في مجموعه من السلالات الظاهرية في F0، والذي يعزي إلى الجينات الوراثية41،42،43 ،44.
اختيار الكائنات الحية
ولأغراض تيسير الدراسات المقبلة بشان الجينوم المقارن للأسماك الكهربائية الضعيفة ، هناك حاجه إلى اختيار نوع تمثيلي لكل من النماذج الرياضية والmormyrids لتطوير البروتوكول. وفي أعقاب المناقشات التي جرت خلال اجتماع 2016 الأسماك الكهربائية في مونتيفيديو ، اوروغواي ، كان هناك توافق في الآراء بين المجتمعات المحلية لاستخدام الأنواع التي يمكن تربيتها بالفعل في المختبر والتي تتوفر لديها موارد جينيه. وقد تم اختيار الأنواع التي تناسب هذه المعايير والتي تم تحديدها بالشكل المثالي لهذا النوع من الكائنات. في كلا النوعين ، من السهل تقليد العظة الطبيعية للحث علي ظروف التكاثر والحفاظ عليها في الأسر. B. gauderio، الأنواع عاريه الشكل من أمريكا الجنوبية ، لديه ميزه انخفاض متطلبات التربية: يمكن الاحتفاظ بالأسماك في كثافة عاليه نسبيا في الدبابات الصغيرة نسبيا (4 لتر). B. gauderio لديها أيضا دوران الأجيال بسرعة في ظل ظروف الأسير. تحت الظروف المختبرية ، b. gauderio يمكن ان تتطور من البيض إلى الكبار في حوالي 4 أشهر.
B. بالضغط الذاتي ، وهو نوع من الأسماك القنوميه من غرب وسط افريقيا ، والسلالات بسهوله في الأسر. B. بسهوله المتاحة من خلال التجارة حوض السمك ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في العديد من الدراسات ، والآن لديها عدد من الموارد الجينوم المتاحة. تمتد دوره حياتهم من 1 − 3 سنوات ، اعتمادا علي الظروف المختبرية. وتعد متطلبات التربية أكثر كثافة إلى حد ما بالنسبة لهذه الأنواع ، التي تتطلب دبابات متوسطه الحجم (50 − 100 لتر) بسبب عدوانها اثناء التكاثر.
وينبغي ان تكون المختبرات التي تدرس أنواعا أخرى من الأسماك الكهربائية قادره علي تكييف هذا البروتوكول بسهوله ما دام النوع يمكن ان يولد ، ويمكن جمع أجنه الخلايا الوحيدة وتربيتها في مرحله البلوغ. ومن المرجح ان تتغير معدلات الإسكان وتربيه اليرقات والإخصاب في الأنابيب مع الأنواع الأخرى ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطه انطلاق لمحاولات تربيه في الأسماك الكهربائية الأخرى ضعيفه.
هدف الجينات المثالي لإثبات المفهوم: scn4aa
[مورلي] كهربائيه [مورميريد] و [غنوتيفورم] سمكه يلدون [الكتريك فيلد] ([الكتروجينيسيس]) ب يقيل جهاز يختص, يدعي الجهاز كهربائيه. تصريف الأعضاء الكهربائية (EODs) نتيجة لإنتاج في وقت واحد من إمكانات العمل في خلايا الجهاز الكهربائي يسمي الكتروسيتس. يتم الكشف عن EODs بواسطة مجموعه من المستقبلات الكهربية في الجلد لإنشاء صور كهربائيه عاليه الدقة لمحيط الأسماك45. الأسماك الكهربائية ضعيفه هي أيضا قادره علي الكشف عن ملامح الموجات التخلص من الذخائر المتفجرة الخاصة بهم18 وكذلك معدلات التفريغ الخاصة بهم46، مما يسمح eods للعمل بالاضافه إلى ذلك كاشاره الاتصالات الاجتماعية مماثله للطيور أو الضفدع النطق47.
المكون الرئيسي للعمل توليد المحتملة في الكهرباء من كلا القنوميه وعاريه السمك الكهربائية ضعيف هو الجهد بوابات قناه الصوديوم التنقل 1.42. لاكهربائية تيليوستس التعبير عن نسختين بارالوجوس الجينات ، scn4aa و scn4ab، والترميز لقناه الصوديوم الجهد بوابات التنقل 1.430. في كل من عاريه الشكل و القنوميه الأسماك الكهربائية ضعيفه السلالات, scn4aa تطورت بسرعة وخضع العديد من البدائل الأحماض الامينيه التي تؤثر علي خصائصه الحركية48. الأهم من ذلك ، أصبح scn4aa مجزاه في كلا السلالتين إلى الجهاز الكهربائي2،3. التعبير المقيد نسبيا من scn4aa إلى الجهاز الكهربائي ، فضلا عن دورها الرئيسي في توليد المواد المستنفدة للأوزون ، يجعلها هدفا مثاليا لتجارب الضربة القاضية crispr/كاس 9 ، كما ان لديها الحد الأدنى من الآثار الوخيمة الضارة. لان الأسماك الكهربائية الضعيفة تبدا التفريغ أجهزتهم الكهربائية اليرقات 6 − 8 أيام بعد الإخصاب (DPF) ، واستهداف scn4aa هو مناسبه بشكل مثالي للنمط الظاهري السريع بعد الحقن المجهري الجنين.
Protocol
Representative Results
Discussion
ان الثراء الظاهري للأسماك الكهربائية الضعيفة ، إلى جانب الانتشار الأخير لموارد الجينوم ، يحفز الحاجة القوية للأدوات الجينية الوظيفية في نموذج السمك الكهربائي الضعيف. هذا النظام جذاب بشكل خاص بسبب التطور المتقارب للعديد من الصفات الظاهرية في السلالات المتوازية من الأسماك ، والتي يتم الا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعترف المؤلفون بالجهود البطولية التي بذلتها مونيكا لوكاس ، وكاثرين شو ، وريان تايلور ، وجاريد تومسون ، ونيكول روبيهرود ، وهوب هيلي للمساعدة في تربيه الأسماك ، وجمع البيانات ، وتطوير البروتوكولات المبكرة. ونود أيضا ان نشكر المستعرضين الثلاثة علي اقتراحاتهم المقدمة إلى المخطوطة. ونحن نعتقد ان المنتج النهائي لتكون ذات نوعيه أفضل بعد معالجه تعليقاتهم. وقد تم تمويل هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم #1644965 و#1455405 إلى JRG ، ومنحه المدير الخاص لمجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية إلى VLS.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
References
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
- Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system–twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
- Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
- Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
- Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
- Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
- Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
- Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
- Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
- Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
- Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
- Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
- Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
- Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
- Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
- Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
- Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
- Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
- Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
- Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
- Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
- Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
- Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
- Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
- Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
- Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
- Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
- Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
- Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
- Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
- Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
- Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
- Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
- Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
- van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
- Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
- Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
- Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
- Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
- Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
- Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
- Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
