Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish
Summary
Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.
Abstract
L’elettroricezione e l’elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. C’è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un’architettura genetica comune. Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni trascorsi dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l’elettricità per percepire l’ambiente circostante e comunicare, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi informazioni sull’evoluzione dello sviluppo, dei sistemi e dei circuiti delle neuroscienze, fisiologia cellulare, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Più recentemente, c’è stata una proliferazione di risorse genomiche per i pesci elettrici. L’uso di queste risorse ha già facilitato importanti intuizioni per quanto riguarda la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie. Uno dei principali ostacoli all’integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali. Riportiamo qui un protocollo completo per l’esecuzione della mutagenesi CRISPR/Cas9 che utilizza meccanismi endogeni di riparazione del DNA nei pesci debolmente elettrici. Dimostriamo che questo protocollo è altrettanto efficace sia nella specie mormyrid Brienomyrus brachyistius che nella gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio utilizzando CRISPR/Cas9 per colpire indels e mutazioni puntiformi nel primo esone del gene del canale di sodio scn4aa. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti embrioni di entrambe le specie e si sono genotiper per confermare che le mutazioni previste nel primo esone del canale di sodio scn4aa erano presenti. Il fenotipo di successo è stato confermato con registrazioni che mostrano una riduzione delle ampiezza di scarico dell’organo elettrico rispetto ai controlli non iniettati.
Introduction
L’elettroricezione e l’elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. Due lignaggi di pesce teleost, osteoglossiformes e siluri, hanno evoluto l’elettroricezione in parallelo, e cinque lignaggi di teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e il genere Astroscopus, Malapterurus e Synodontis) elettrogenesi evoluta in parallelo. C’è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un’architettura genetica comune1,2,3.
Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie, che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l’elettricità per percepire l’ambiente circostante e comunicare4, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi intuizioni sull’evoluzione dello sviluppo1,5 ,6, sistemi e circuiti neuroscienze7,8,9,10, fisiologia cellulare11,12, ecologia ed energiche13 ,14,15,16,17, comportamento18,19e macroevoluzione3,20,21 .
Più recentemente, c’è stata una proliferazione di risorse genomiche, trascrittomiche e proteomiche perilpesce elettrico 1,22,23,24,25,26, 27,28. L’uso di queste risorse ha già prodotto importanti intuizioni riguardanti la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie1,2,3,28,29 ,30. Un grande ostacolo all’integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali31.
Uno di questi strumenti è la tecnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats di recente sviluppo in coppia con la tecnica Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 è uno strumento di editing del genoma che è entrato in uso diffuso sia nel modello32,33,34 e organismi non modello35,36,37 allo stesso modo. La tecnologia CRISPR/Cas9 è progredita fino a un punto in cui un laboratorio in grado di biologia molecolare di base può facilmente generare sonde specifiche del gene chiamate RNA guida corta (sgRNA), a basso costo utilizzando un metodo non di clonazione38. CRISPR ha vantaggi rispetto ad altre strategie di knockout/knockdown, come i morfolino39,40, le nucleasi effettore simili a attivatori di trascrizione (TALENs) e le nucleasi di dito di zinco, che sono costose e che richiede molto tempo per generare per ogni gene bersaglio.
Il sistema CRISPR/Cas9 funziona per creare eliminazioni genetiche prendendo di mira una regione specifica del genoma, diretta dalla sequenza sgRNA, e causando una rottura a doppio filamento. La rottura a doppio filamento viene rilevata dalla cellula e attiva preferibilmente meccanismi endogeni di riparazione del DNA utilizzando il percorso di giunzione finale non omologa (NHEJ). Questo percorso è altamente soggetto a errori: durante il processo di riparazione, la molecola di DNA spesso incorpora inserimenti o delezioni (indel) nel sito di rottura a doppio filamento. Questi indels possono comportare una perdita di funzione a causa di (1) spostamenti nel frame di lettura aperto, (2) inserimento di un codone di arresto prematuro o (3) cambiamenti nella struttura primaria critica del prodotto genetico. In questo protocollo, utilizziamo l’editing CRISPR/Cas9 per individuare mutazioni di punti bersaglio nei geni bersaglio usando il NHEJ in specie di pesci debolmente elettriche. Mentre più semplice e più efficiente di altre tecniche, questo metodo di mutagenesi si prevede di provocare una gamma di gravità fenotipica in F0, che è attribuito al mosaicismo genetico41,42,43 ,44.
Selezione degli organismi
Al fine di facilitare gli studi futuri sulla genomica comparativa dei pesci debolmente elettrici, era necessario selezionare una specie rappresentativa sia per gymnotiformi che per gli omestidi per lo sviluppo del protocollo. A seguito delle discussioni durante l’incontro del pesce elettrico del 2016 a Montevideo, in Uruguay, c’era un consenso della comunità per l’utilizzo di specie che potevano già essere allevate in laboratorio e che avevano risorse genomiche disponibili. La gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio e il mormyrid Brienomyrus brachyistius sono stati selezionati come specie che si adattano a questi criteri. In entrambe le specie, i segnali naturali per indurre e mantenere le condizioni di allevamento sono facili da imitare in cattività. B. gauderio, una specie gymnotiforme del Sud America, ha il vantaggio di bassi requisiti di allevamento: i pesci possono essere mantenuti ad una densità relativamente elevata in vasche relativamente piccole (4 L). B. gauderio ha anche un rapido ricambio generazionale in condizioni dicattività. In condizioni di laboratorio, B. gauderio può svilupparsi da uovo a adulto in circa 4 mesi.
B. brachyistius, una specie di pesce mormyrid dell’Africa centro-occidentale, nidifica prontamente in cattività. B. brachyistius è prontamente disponibile attraverso il commercio dell’acquario, è stato ampiamente utilizzato in molti studi, e ora ha una serie di risorse genomiche disponibili. Il loro ciclo di vita dura 1 o 3 anni, a seconda delle condizioni di laboratorio. I requisiti dell’allevamento sono un po’ più intensi per questa specie, richiedendo vasche di dimensioni moderate (50-100 L) a causa della loro aggressività durante l’allevamento.
I laboratori che studiano altre specie di pesci elettrici dovrebbero essere in grado di adattare facilmente questo protocollo fintanto che la specie può essere allevata e gli embrioni a singola cellula possono essere raccolti e allevati fino all’età adulta. L’alloggio, l’allevamento larvale e i tassi di fecondazione in vitro (IVF) probabilmente cambieranno con altre specie; tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per i tentativi di allevamento in altri pesci debolmente elettrici.
Un obiettivo gene ideale per la prova di concetto: scn4aa
I pesci mormyrid e gymnotiformi poco elettrici generano campi elettrici (elettrogenesi) scaricando un organo specializzato, chiamato organo elettrico. Le scariche di organi elettrici (EOD) derivano dalla produzione simultanea di potenziali d’azione nelle cellule di organi elettrici chiamati elettrociti. Gli EOD vengono rilevati da una serie di elettrorecettori nella pelle per creare immagini elettriche ad alta risoluzione dell’ambiente circostante del pesce45. I pesci poco elettrici sono anche in grado di rilevare le caratteristiche delle forme d’onda EOD dei loro conspecifici18 così come i loro tassi di scarico46, permettendo alle EOD di funzionare in aggiunta come segnale di comunicazione sociale analogo al canto degli uccelli o alla rana vocalizzazioni47.
Una componente principale della generazione potenziale di azione negli elettrociti del pesce mormyrid e gymnotiforme debolmente elettrico è il canale di sodio NaV1.42. I teleost s’esolti non elettrici esprimono due copie geniche paralologie, scn4aa e scn4ab, codificando per il canale di sodio NaV1.430. In entrambe le linee di pesce gymnotiformi e mormyrid debolmente elettriche, scn4aa si è evoluto rapidamente e ha subito numerose sostituzioni di amminoacidi che influenzano le sue proprietà cinetiche48. Ancora più importante, scn4aa è diventato compartimentato in entrambi i lignaggi per l’organo elettrico2,3. L’espressione relativamente limitata di scn4aa all’organo elettrico, così come il suo ruolo chiave nella generazione di EOD, lo rende un bersaglio ideale per gli esperimenti di knockout CRISPR/Cas9, in quanto ha effetti pleiotropici deleteri minimi. Poiché i pesci debolmente elettrici iniziano a scaricare i loro organi elettrici larvali 6-8 giorni dopo la fecondazione (DPF), il targeting dello scn4aa è ideale per la fenotipizzazione rapida dopo la microiniezione dell’embrione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricchezza fenotipica dei pesci debolmente elettrici, insieme a una recente proliferazione delle risorse genomiche, motiva un forte bisogno di strumenti genomici funzionali nel modello di pesce debolmente elettrico. Questo sistema è particolarmente attraente a causa della convergente evoluzione di numerosi tratti fenotipici in linee parallele di pesci, che sono facilmente conservati in laboratorio.
Il protocollo qui descritto dimostra l’efficacia della tecnica CRISPR/Cas9 nei lignaggi di pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono gli sforzi eroici di Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey per l’aiuto con l’allevamento dei pesci, la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo iniziale. Vorremmo anche ringraziare i tre recensori per i loro suggerimenti al manoscritto. Crediamo che il prodotto finale sia di migliore qualità dopo aver affrontato i loro commenti. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno della National Science Foundation #1644965 e #1455405 al JRG, e dalla sovvenzione della DG del Consiglio per le Scienze Naturali e la Ricerca Ingegneria a VLS.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
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